Nano Lett.┃电荷反转仿生纳米复合物用于脑胶质瘤的RNAi治疗

英文原题：Charge Conversional Biomimetic Nanocomplexes as a Multifunctional Platform for Boosting Orthotopic Glioblastoma RNAi Therapy

通讯作者：郑蒙，河南大学；Omid C. Farokhzad，哈佛医学院；师冰洋，河南大学

作者：Yanjie Liu, Yan Zou, Chan Feng, Albert Lee, Jinlong Yin, Roger Chung, Jong Bea Park, Helen Rizos,Wei Tao, Meng Zheng,* Omid C. Farokhzad,* and Bingyang Shi*

脑胶质瘤 (GBM) 是中枢神经系统中最常见、最具侵袭性的肿瘤，目前临床上仍无法治愈。在尽可能保护脑功能前提下，最大程度切除肿瘤，术后同步放化疗是脑胶质瘤的标准治疗方法，但患者复发率仍接近100%。另外，这种治疗方法预后极差，中位生存期仅为9-12个月，2年生存率也仅为8%-12%。

为了实现脑胶质瘤的高效治疗，河南大学师冰洋教授团队设计了一种红细胞膜（RBCm）伪装的小分子干扰RNA（siRNA）运载系统，用于GBM的基因治疗。如图1所示，该多功能纳米复合物 (Ang-RBCm-CA/siRNA) 主要是由三部分组成：1) Angiopep-2修饰的血红细胞膜作为外壳 (Ang-RBCm)，这不仅延长了纳米药物的血液循环时间，还可以实现由LPR-1受体介导的BBB穿透和GBM靶向。2) 柠康酸酐接枝聚赖氨酸 (PLL-CA) 作为表面带负电荷的中间层，能够在肿瘤细胞的酸性环境下转化为正电荷，进而促使RBCm的破裂和纳米复合物的解聚。3) 聚乙烯亚胺 (PEI) siRNA复合物通过静电相互作用形成，可以有效的压缩siRNA，并且实现siRNA的内涵体逃逸。该多功能仿生siRNA纳米复合物有效解决了siRNA目前面临的半衰期短、血脑屏障 (BBB) 穿透差、肿瘤积累不足、细胞摄取差等难题，可以实现脑胶质瘤的高效治疗。

图1. 电荷转换仿生siRNA纳米药物的制备及治疗脑胶质瘤示意图。

该团队首先通过4项体外实验对纳米复合物的性能进行了表征（图2）。透射电子显微镜和琼脂糖凝胶电泳结果分析表明，在模拟肿瘤细胞的酸性环境下，纳米复合物彻底裂解，siRNA有效释放，而用琥珀酸酐接枝聚赖氨酸 (PLL-SA，无酸敏感特性) 代替PLL-CA制备的纳米复合物的结构在相同条件下保持完好，说明Ang-RBCm-CA/siRNA能够通过电荷反转实现siRNA的高效释放。通过检测纳米复合物的粒径和电位变化，表明该纳米复合物在中性条件下保持稳定，而在酸性条件下粒径变大，电荷由负变正。这些结果证明，该仿生siRNA纳米复合物可以通过电荷反转诱发细胞膜破裂，从而实现siRNA释放。

图2. 纳米复合物的pH响应性实验：(a) 透射电子显微镜图像；(b) 纳米复合物形态随pH变化示意图；(c) 聚丙烯酰胺凝胶电泳图像；(d) 粒径变化结果；(e) 电位变化结果。

该团队接着利用U87-Luc细胞模型研究了Ang-RBCm-CA/siRNA的治疗效果（图3）。细胞毒性实验结果表明，该纳米复合物的生物安全性良好。为了研究 Ang-RBCm-CA/siRNA体外基因沉默效率，转染实验首先选用 siGL3进行细胞实验。结果显示荧光素酶表达被Ang-RBCm-CA/siGL3显著下调。而RT-PCR、Western Blot和细胞凋亡实验则选用siPLK1进行实验，进一步验证了该体系能大量敲除靶基因。团队进一步评估了 Ang-RBCm-CA/siRNA 在体内的治疗效果（图4）。实验以 siPLK1 作为治疗siRNA，以荷 U87-Luc 原位脑胶质瘤的裸鼠为肿瘤模型。通过荧光成像跟踪肿瘤生长情况，定性及定量分析结果表明，Ang-RBCm-CA/siPLK1显著抑制肿瘤增长。此外，Ang-RBCm-CA/siPLK1组小鼠体重几乎无变化，而对照组的体重则显著下降。生存曲线显示 Ang-RBCm-CA/siPLK1治疗组小鼠生存期明显延长。该研究证实了仿生纳米复合物Ang-RBCm-CA/siRNA对原位人脑胶质瘤小鼠具有较好的治疗效果，且对全身的副作用较少。值得注意的是，该纳米复合物具有生物相容性好、血液半衰期长、BBB穿透能力强、肿瘤聚集性强、pH诱导的膜裂解和siRNA的调控释放等特点。这种新型的多功能仿生纳米复合物为靶向GBM基因治疗提供了一个强有力的的平台。

图3. 纳米复合物体外 siGL3 及 siPLK1 基因沉默及毒性实验：(a) 纳米复合物的细胞毒性实验；(b) 体外荧光素实验；(c-d) RT-PCR和Western Blot实验结果；(e) 细胞凋亡实验。

图4. 荷 U87-Luc 原位脑胶质瘤异种移植裸鼠的体内治疗实验：(a) 脑胶质瘤治疗流程示意图；(b) 各治疗组脑部U87-Luc定性图片；(c) 各治疗组脑部U87-Luc定量图；(d) 各治疗组的肿瘤抑制率图；(e) 各治疗组的体重变化；(f) 各治疗组的生存周期；(g-h) 体内RT-PCR和Western Blot实验结果。

这一成果近期发表在Nano Letters 上，河南大学博士研究生刘艳杰、邹艳博士和哈佛医学院Chan Feng为文章的共同第一作者，郑蒙、Omid C. Farokhzad、师冰洋教授为通讯作者。

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Charge Conversional Biomimetic Nanocomplexes as a Multifunctional Platform for Boosting Orthotopic Glioblastoma RNAi Therapy

Yanjie Liu, Yan Zou, Chan Feng, Albert Lee, Jinlong Yin, Roger Chung, Jong Bea Park, Helen Rizos, Wei Tao, Meng Zheng*, Omid C. Farokhzad*, Bingyang Shi*

Nano Lett., 2020, DOI: 10.1021/acs.nanolett.9b04683

Publication Date: February 3, 2020

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（本稿件来自ACS Publications）