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Nature子刊：新方法解密纳米粒子载体形状对胞内运输及药物释放的影响
高分子纳米粒子能运载药物来杀死癌细胞，并选择性地在病灶部位释放药物，在疾病的诊断和治疗中取得了突破性的研究成果。众所周知，纳米载体的大小、形状、表面电荷以及材料的组分都会影响细胞摄入的速率、效率和内吞机理，进而影响载药的效率。长期以来，科学家们在设计药物载体时都会被这样的问题所困扰：纳米粒子的物理性质是如何影响细胞摄入，以及其在细胞内是如何穿过如质膜、内含体及核被膜这些屏障的？目前，这些研究受限于绘制纳米粒子穿过亚细胞器分界线图谱的方法。
Justin Gooding教授（左一）和Katharina Gaus教授（中）。图片来源：NSW
近日，来自澳大利亚新南威尔士大学（University of New South Wales）的Katharina Gaus教授（点击查看介绍）与Justin Gooding教授（点击查看介绍）成功地解决了这个难题。他们通过结合一种新型的荧光显微镜以及自相关和对相关的统计学分析方法，首次绘制出每一个纳米粒子如何在细胞内传递的清晰画面。这种方法能使得他们在单个细胞中追踪不同形状的纳米粒子的位置和运动过程，并且有非常高的时间和空间分辨率。由此他们证明形状如棒和蠕虫的纳米颗粒比球形颗粒能更有效地穿过细胞障碍而到达细胞核内。此外，他们还能够确定药物释放的具体位置以及扩散到整个细胞中的方式。这项研究成果发表在Nature Nanotechnology杂志上。（Pair correlation microscopy reveals the role of nanoparticle shape in intracellular transport and site of drug release, Nat. Nanotech., 2016, DOI: 10.1038/NNANO.2016.160）。
纳米粒子进入核内所需要克服的三道屏障。（a）质膜屏障（b）从内涵体进入细胞质的屏障（c）核被膜的屏障。图片来源：Nat. Nanotech.
研究人员设计合成了四种类型的聚合物纳米粒子：胶束、囊泡、棒状和蠕虫状。前两种属于球形，而后两种属于高长径比的类型。将荧光素标记的纳米粒子与细胞共孵育6小时，并用探针标记细胞核之后，研究人员选取从细胞外穿过细胞质到细胞核的一条直线，快速扫描线上的64个像素，并整合成随时间变化的强度图谱，也称之为波动曲线图。
图示棒状纳米粒子在细胞内的浓度分布（左）、运动粒子的数目分布（中）和粒子运输时间的分布。EX：细胞外；CYTO：细胞质；NUC：细胞核。图片来源：Nat. Nanotech.
研究人员从荧光强度图可以观察到纳米粒子在细胞不同位置的浓度分布图，通过自相关分析可以得到运动粒子的数目分布，再通过引入对相关函数得到粒子运输时间的分布。粒子的运输时间越长，表示粒子遇到的阻碍越大，也就意味着克服亚细胞器间的障碍越难。研究人员以棒状纳米粒子为例，通过这种方法研究发现，棒状纳米粒子在核被膜处遇到的屏障最大，这个结果与核内纳米粒子浓度与运动粒子的数目最小的现象相符合。
形状对运动粒子的数目（左）及粒子穿过屏障能力（右）的影响。图片来源：Nat. Nanotech.
接下来，研究人员采用相同的方法研究了不同的形状对运动粒子的数目及粒子穿过细胞屏障能力的影响。结果表明，质膜对四种粒子的阻碍是相似的，但球形颗粒不能够进入到细胞核中，而棒状和蠕虫状可以进入到细胞核中，且它们克服核被膜的屏障要远远难于质膜的屏障。
形状对穿越由内涵体进入细胞质屏障的影响。图片来源：Nat. Nanotech.
接着，研究人员形状对第二层屏障的影响。他们发现，四种形状的粒子都能在早期内涵体和晚期内涵体中富集，而且都能够逃逸内涵体进入到细胞质中。
核定位信号肽的修饰对纳米粒子穿越核被膜屏障的影响。图片来源：Nat. Nanotech.
第三层屏障来源于通过核孔复合物穿越核被膜的阻碍。研究人员发现通过修饰核定位信号肽，棒状和蠕虫状颗粒在细胞核内的富集能分别提高5倍和10倍。进一步研究发现，若不修饰核定位信号肽，纳米粒子进入细胞核与离开细胞核的能力相同，因而粒子在核内富集较小。而核定位信号肽的修饰，可以促进粒子进入核的能力，因而会使粒子在细胞核内的富集量增多。
确定药物释放的位置。图片来源：Nat. Nanotech.
最后，为了确定药物在细胞内的释放位置，研究人员将药物装载于纳米粒子中，与细胞孵育后进行荧光成像。对单个通道进行对相关分析，并对两个通道作互相关分析，最后通过比较两者之间的差异，就能获得自由药物与结合药物的扩散路径，以此确定药物释放的位置。研究结果表明，在0.25小时内，四种形状的纳米粒子运输粒子进入细胞质的效率几乎一样；而在6-24小时内，采用球形运载的药物在细胞质内明显减少，而高长径比的载体却大量增加。此外，采用高长径比的载体将药物运输到细胞核内的量远远高于球形载体。这说明仅通过自由药物的扩散并不是由细胞质进入细胞核的有效途径，这也表明了采用载体直接运输的优势。
文章第一作者Elizabeth Hinde博士展望道，“由于癌细胞与正常细胞有着不同的内部结构，如果我们可以微调这些纳米载体的三维，让其只通过癌细胞的细胞屏障，就可以减少一些化疗疗法的副作用。”
Justin Gooding教授谈道这篇论文的意义时说道，“这项研究对该领域的影响是巨大的，它不仅让我们看到粒子在细胞内做什么，而且可以按我们所想来设计它们。该研究得益于我们所开发的新的分析方法，只要其他研究小组学会这种分析方法，他们就能使用实验室已有的设备来和我们一样获得各种颗粒在细胞内崭新的信息。”
http://www.nature.com/nnano/journal/vaop/ncurrent/full/nnano.2016.160.html
（本文由冰供稿）