真菌大环内酯类抗线虫化合物的生物合成与工程化改造

真菌聚酮-非核糖体肽 (PK-NRP) 类天然产物具有复杂的化学结构和良好的生物活性，是新药开发的重要来源之一。传统的真菌PKS-NRPS合成酶通常由一个高度还原的PKS module和一个NRPS module融合组成，其中NRPS module通常以R/R* domain结尾，催化PK-NRP链的还原释放或Dieckmann 环化释放（Figure 1, A and B）。真菌中也存在非传统的PK-NRP天然产物合成方式，如wortmanamides和tenuazonic acid （Figure 1, C and D）。本研究关注来源于真菌的第三类非传统single-module PK-NRP类天然产物，与之前报道的真菌PK-NRP类天然产物不同，该类化合物具有独特的大环内酯结构（Figure 1, E），其中最重要的例子为极端嗜热真菌来源的thermolides家族天然产物（含有D-构型氨基酸的13元环大环内酯，前期报道）。酰基化的thermolides家族天然产物具有极强的抗线虫活性，是新型抗线虫生物农药的潜在开发资源之一。

Figure 1. Release mechanisms of fungal single-module PK-NRP hybrids.

Figure 2. Confirmation of the Thm gene cluster and the configuration of amino acids.

本文首先通过生物信息学分析结合构巢曲霉异源表达的方法确定了thermolides真正的生物合成基因簇（Thm, Figure 2, A）。与传统的single-module PKS-NRPS合成酶不一样，hrPKS和NRPS module是两个独立的酶（ThmA和ThmB），其中NRPS module以末端C domain（C_T）结尾。通过不同组合确定了thermolides的最小合成基因单元为ThmABCE，产量较原始菌株提高了约200倍（Figure 2, B）。通过水解衍生方法，修正thermolides家族天然产物的氨基酸构型为L构型（Figure 2, C and D）。

Figure 3. Confirmation of the Thm gene functions in vivo and in vitro.

进一步实验表明，组合ThmAB基因能生成C6-Ketone未被KR domain还原的大环内酯骨架化合物6和7（Figure 3, A），从而推测ThmB C_T domain催化了PK-NRP链之间酯键的生成，从而释放产物（Figure 3, B），这是真菌NRPS C domain的全新功能。通过遗传进化树分析，ThmB C_T domain确实处于独立分支（Figure 4, A）。从S. cerevisiae BJ5464-NpgA中表达并纯化了ThmA和ThmB蛋白，体外成功重构了6和7的生成（Figure 3, C）。进一步关键活性motif“HHxxxD”的点突变和回补实验证实（Figure 4, B），ThmB C_T domain第二个组氨酸残基（H₁₂₃₂）负责了PK-NRP链之间酯键的形成。

Figure 4. Confirmation of the ThmB-C_T domain function.

Figure 5. Biochemical analyses of the functions of ThmC and ThmE in vitro.

随后，作者对thermolides生物合成中后修饰步骤进行了探讨（Figure 5, A）。通过ThmC和ThmE对不同底物等摩尔浓度下的体外竞争性time course实验（Figure 5, B），揭示了thermolides后修饰的优先合成途径为先经ThmE催化C16-OH的乙酰化（C18-OH的乙酰化反应是分子内的酰基转移过程），再由ThmC催化C6-Ketone的还原（Figure 5, C）。

Figure 6. Expand the esterification diversity of ThmE.

随后，作者探讨了thermolide酯化改造的可能性。ThmE与不同链长CoA底物的体外实验表明，ThmE具有宽泛的底物选择性，ThmE能催化不同链长的单一或混合形式的酰基-CoA加载到thermolide骨架上（Figure 6, A）。为了得到新型的thermolides酯化产物，作者在E. coli中共表达了ThmC和ThmE，体内喂养母核产物（7）产生了不同链长的酰基化产物，通过分离最终获得了丁酰化的thermolide J (15)和K (16)（Figure 6, B）。

Figure 7. Genome mining-based combinatorial biosynthesis for the discovery of new thermolides

随后，作者以ThmA和ThmB为探针进行了真菌基因组挖掘，总共得到了8个类似的大环内酯基因簇，其中来源于镰刀菌的基因簇Fca与Thm基因簇高度同源（Figure 7）。构巢曲霉异源表达FcaA和FcaB得到了L-Phe作为氨基酸的thermolide骨架产物（17），这也是芳香族氨基酸类thermolide的首次报道。Fca和Thm基因簇中骨架基因FcaA/FcaB和ThmA/ThmB的成功互换实验说明两个基因簇在功能上是互补的。进一步通过FcaAB和ThmCE的组合生物合成得到了终产物thermolides L(18)和M (19)。

总结

该研究阐明了极端嗜热真菌single-module PK-NRP杂合大环内酯thermolide类天然产物的独特合成方式，证实了ThmB C_T domain催化了PK-NRP链之间酯键的生成，充实了真菌NRPS C domain的功能库，为极端环境来源的微生物天然产物生物合成的研究提供了依据。通过异源表达、代谢工程以及基因组挖掘结合组合生物合成等方法，不仅实现了thermolides的高效生产，同时创制了结构更为丰富的thermolides衍生物，为后续抗线虫药物的开发提供了更多的可能。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Heterologous and Engineered Biosynthesis of Nematocidal Polyketide–Nonribosomal Peptide Hybrid Macrolactone from Extreme Thermophilic Fungi

Jin-Mei Zhang, Hang-Hang Wang, Xuan Liu, Chang-Hua Hu, Yi Zou

J. Am. Chem. Soc., 2020, 142, 1957-1965, DOI: 10.1021/jacs.9b11410