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真菌大环内酯类抗线虫化合物的生物合成与工程化改造

真菌聚酮-非核糖体肽 (PK-NRP) 类天然产物具有复杂的化学结构和良好的生物活性,是新药开发的重要来源之一。传统的真菌PKS-NRPS合成酶通常由一个高度还原的PKS module和一个NRPS module融合组成,其中NRPS module通常以R/R* domain结尾,催化PK-NRP链的还原释放或Dieckmann 环化释放(Figure 1, A and B)。真菌中也存在非传统的PK-NRP天然产物合成方式,如wortmanamides和tenuazonic acid (Figure 1, C and D)。本研究关注来源于真菌的第三类非传统single-module PK-NRP类天然产物,与之前报道的真菌PK-NRP类天然产物不同,该类化合物具有独特的大环内酯结构(Figure 1, E),其中最重要的例子为极端嗜热真菌来源的thermolides家族天然产物(含有D-构型氨基酸的13元环大环内酯,前期报道)。酰基化的thermolides家族天然产物具有极强的抗线虫活性,是新型抗线虫生物农药的潜在开发资源之一。

Figure 1. Release mechanisms of fungal single-module PK-NRP hybrids.


Figure 2. Confirmation of the Thm gene cluster and the configuration of amino acids.


本文首先通过生物信息学分析结合构巢曲霉异源表达的方法确定了thermolides真正的生物合成基因簇(Thm, Figure 2, A)。与传统的single-module PKS-NRPS合成酶不一样,hrPKS和NRPS module是两个独立的酶(ThmA和ThmB),其中NRPS module以末端C domain(CT)结尾。通过不同组合确定了thermolides的最小合成基因单元为ThmABCE,产量较原始菌株提高了约200倍(Figure 2, B)。通过水解衍生方法,修正thermolides家族天然产物的氨基酸构型为L构型(Figure 2, C and D)。

Figure 3. Confirmation of the Thm gene functions in vivo and in vitro.


进一步实验表明,组合ThmAB基因能生成C6-Ketone未被KR domain还原的大环内酯骨架化合物67Figure 3, A),从而推测ThmB CT domain催化了PK-NRP链之间酯键的生成,从而释放产物(Figure 3, B),这是真菌NRPS C domain的全新功能。通过遗传进化树分析,ThmB CT domain确实处于独立分支(Figure 4, A)。从S. cerevisiae BJ5464-NpgA中表达并纯化了ThmA和ThmB蛋白,体外成功重构了67的生成(Figure 3, C)。进一步关键活性motif“HHxxxD”的点突变和回补实验证实(Figure 4, B),ThmB CT domain第二个组氨酸残基(H1232)负责了PK-NRP链之间酯键的形成。

Figure 4. Confirmation of the ThmB-CT domain function.


Figure 5. Biochemical analyses of the functions of ThmC and ThmE in vitro.


随后,作者对thermolides生物合成中后修饰步骤进行了探讨(Figure 5, A)。通过ThmC和ThmE对不同底物等摩尔浓度下的体外竞争性time course实验(Figure 5, B),揭示了thermolides后修饰的优先合成途径为先经ThmE催化C16-OH的乙酰化(C18-OH的乙酰化反应是分子内的酰基转移过程),再由ThmC催化C6-Ketone的还原(Figure 5, C)。

Figure 6. Expand the esterification diversity of ThmE.


随后,作者探讨了thermolide酯化改造的可能性。ThmE与不同链长CoA底物的体外实验表明,ThmE具有宽泛的底物选择性,ThmE能催化不同链长的单一或混合形式的酰基-CoA加载到thermolide骨架上(Figure 6, A)。为了得到新型的thermolides酯化产物,作者在E. coli中共表达了ThmCThmE,体内喂养母核产物(7)产生了不同链长的酰基化产物,通过分离最终获得了丁酰化的thermolide J (15)和K (16)(Figure 6, B)。

Figure 7. Genome mining-based combinatorial biosynthesis for the discovery of new thermolides


随后,作者以ThmA和ThmB为探针进行了真菌基因组挖掘,总共得到了8个类似的大环内酯基因簇,其中来源于镰刀菌的基因簇FcaThm基因簇高度同源(Figure 7)。构巢曲霉异源表达FcaAFcaB得到了L-Phe作为氨基酸的thermolide骨架产物(17),这也是芳香族氨基酸类thermolide的首次报道。FcaThm基因簇中骨架基因FcaA/FcaBThmA/ThmB的成功互换实验说明两个基因簇在功能上是互补的。进一步通过FcaABThmCE的组合生物合成得到了终产物thermolides L(18)和M (19)。


总结


该研究阐明了极端嗜热真菌single-module PK-NRP杂合大环内酯thermolide类天然产物的独特合成方式,证实了ThmB CT domain催化了PK-NRP链之间酯键的生成,充实了真菌NRPS C domain的功能库,为极端环境来源的微生物天然产物生物合成的研究提供了依据。通过异源表达、代谢工程以及基因组挖掘结合组合生物合成等方法,不仅实现了thermolides的高效生产,同时创制了结构更为丰富的thermolides衍生物,为后续抗线虫药物的开发提供了更多的可能。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Heterologous and Engineered Biosynthesis of Nematocidal Polyketide–Nonribosomal Peptide Hybrid Macrolactone from Extreme Thermophilic Fungi

Jin-Mei Zhang, Hang-Hang Wang, Xuan Liu, Chang-Hua Hu, Yi Zou

J. Am. Chem. Soc., 2020, 142, 1957-1965, DOI: 10.1021/jacs.9b11410


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