Angew. Chem.：纳米MOF用于CpG运载与光动力疗法协同增强树突状细胞活化与癌症免疫治疗

在肿瘤发生过程中，肿瘤组织能通过多条路径阻碍机体免疫系统介导的抗肿瘤反应，包括减弱肿瘤抗原递呈，促进抑制细胞表达负调控因子，激活免疫检测点信号诱导T细胞的耗竭与凋亡等。程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）是表达在T细胞表面的免疫检测点分子，阻断PD-1与其配体PD-L1的结合，能够恢复T细胞活性，增强机体的抗肿瘤免疫。以抗PD-1和抗PD-L1抗体介导的免疫检测点阻断疗法（checkpoint blockade immunotherapy）已在美国、欧洲和中国获批用于临床治疗。然而，由于实体瘤内复杂的免疫微环境，PD-1/PD-L1抗体作为单一疗法并不能完全克服免疫耐受激活机体的肿瘤特异性免疫反应，因此，寻找有效的局部疗法激活免疫系统，协同增强免疫检测点阻断疗法成为当务之急。

芝加哥大学的林文斌教授（点击查看介绍）团队一直致力于研发新型纳米药物协同免疫疗法用于癌症治疗，并在该领域发表了一系列的工作，包括首次报道低剂量X-ray辐射动力疗法结合小分子免疫治疗（Nat. Biomed. Eng., 2018, 2, 600）并用于肿瘤抗转移（Matter, 2019）；首次系统地比较不同放疗增敏剂与辐射增强的构效关系用于增强放疗的远端效应（Nat. Commun., 2018, 9, 2351）；首次实现利用致敏性光动力治疗增强免疫疗法（J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 12502）, 以及进一步克服肿瘤乏氧的光动力治疗用于增强免疫疗法（J. Am. Chem. Soc., 2018, 140, 5670）和光动力与荷尔蒙平衡协同产生自由基增强免疫疗法（Chem, 2019, 5, 1892）；这一系列开创性工作实现了利用纳米金属有机框架介导局部疗法调控肿瘤微环境，并协同免疫检查点阻断疗法实现激活系统性抗肿瘤免疫的构想。

光动力疗法是一种通过特定波长光照刺激光敏剂生成单线态氧等活性氧物种实现肿瘤定向清除的高效非侵入的癌症疗法，可以有效诱导肿瘤细胞产生免疫原性死亡，释放肿瘤抗原。另一方面，胞嘧啶-鸟嘌呤寡核苷酸（CpG）作为Toll样受体-9激动剂，可以有效激活免疫系统内的树突状细胞增强抗原递呈，但由于其自身的负电性与细胞膜表面磷脂发生静电互斥，CpG难以被树突状细胞有效的胞吞。鉴于此，研究人员合成了阳离子骨架的钨基卟啉纳米金属有机框架作为负载CpG的纳米光敏剂，促进CpG的胞吞以活化肿瘤微环境内的树突状细胞，增强抗原递呈与非特异性免疫，同时利用致敏性光动力疗法提高肿瘤抗原释放，再与PD-L1免疫检测点抗体阻断结合，从而实现协同治疗（图1）。

图1. 钨基nMOF用于胞嘧啶-鸟嘌呤寡核苷酸运载与光动力疗法并结合免疫检测点阻断用于增强系统免疫响疗法的示意图。

研究人员首先通过溶剂热法将六氯化钨与四苯基卟啉组装合成，通过调控温度和浓度得到了具有阳离子骨架的纳米光敏剂（W-TBP），这是被报道的第一例钨作为金属节点的金属有机框架。研究人员又用类似方法将铋与四苯基卟啉组装合成了中性骨架的Bi-TBP。透射电镜（TEM）、高分辨透射电镜（HRTEM）、原子力显微镜（AFM）及X射线粉末晶体衍射（PXRD）测试表征证明了所合成的纳米材料为四方形的纳米片（图2）。

图2. W-TBP与Bi-TBP的结构分析。W-TBP与Bi-TBP的结构(a,b),TEM (c,d), HRTEM 及 FFT 图样(e,f)及AFM（g,h）。

近边X射线吸收精细结构（XANES）证明所合成W-TBP仍保持正六价价态，紫外可见吸收光谱（UV-Vis）表征了所合成的晶体均保留了卟啉分子光学特性。动态光散射表征了合成纳米晶体的水合粒径，Zeta电位表征了所合成W-TBP与Bi-TBP两种卟啉纳米框架分别具有阳离子和阴离子包被的表面。在与负电荷的CpG作用后离心分离，分别利用Nanodrop测试上清液中未被负载的CpG含量和通过琼脂糖凝胶电泳测试被负载在两种nMOF上的CpG含量。可以清楚看出阳离子骨架的W-TBP可以有效负载CpG（图3）。

图3. W-TBP与Bi-TBP性质分解。(b)W-TBP的XANES。(a,c-e) W-TBP与Bi-TBP的PXRD, UV-Vis, DLS和Z-电势。(f)Nanodrop表征负载后上清残留的CpG。(g)琼脂糖凝胶表征W-TBP或Bi-TBP负载的CpG。

接下来，研究人员在细胞和活体两个层面重点考察了W-TBP/CpG体外激活抗原提呈细胞的能力和施加光动力疗法用于小鼠肿瘤模型治疗的效果。首先研究人员分离出骨髓细胞并从中分化出树突状细胞，之后分别用CpG、W-TBP或Bi-TBP负载的CpG（W-TBP/CpG和Bi-TBP/CpG）以及对应浓度的W-TBP或Bi-TBP进行刺激。通过检测上清中两种树突状细胞活化标志物干扰素-α（IFN-α）与白介素-6（IL-6），可以看出W-TBP/CpG通过增强内吞作用实现CpG胞内运输从而活化树突状细胞。在体外细胞毒性实验中，光照后W-TBP与Bi-TBP对杀死肿瘤细胞具有相似的光动力疗效。在小鼠皮下瘤模型上，分别对肿瘤注射W-TBP、Bi-TBP、W-TBP/CpG和Bi-TBP/CpG并进行光照，CpG组与未照光的Bi-TBP/CpG均不能抑制肿瘤生长，两种nMOF在动物模型上产生类似的光动力疗效能够部分抑制肿瘤生长。而W-TBP/CpG在光照下可以有效清除肿瘤，证明致敏性光动力疗法结合阳离子运载CpG激活树突状细胞是一种有效的局部肿瘤控制的策略。治疗后，对比血液中的IFN-α与IL-6，以及肿瘤中浸润的巨噬细胞及树突状细胞，其比例与状态都表明W-TBP介导的光动力疗法与CpG运载可以激活非特异性免疫，活化抗原递呈细胞，增强肿瘤内的抗原递呈。

图4. W-TBP的非特异免疫激活。(a,b)W-TBP与Bi-TBP用于CpG介导的树突状细胞活化释放IFN-α与IL-6。(c,d) W-TBP与Bi-TBP的光动力治疗用于细胞杀伤和皮下瘤治疗。(e,f)治疗实施后血液中的IFN-α与IL-6检测。(g,h) 治疗实施后肿瘤中巨噬细胞与树突状细胞的浸润。

基于此，研究人员在Balb/c小鼠上构建乳腺癌双瘤模型，近端瘤给予W-TBP/CpG并照光进行光动力治疗附加树突状细胞活化，远端不予治疗。可以看出单独施加W-TBP/CpG治疗能极大消除近端肿瘤，但对远端瘤抑制能力有限；联用抗PD-L1抗体后实现了很好的远端效应抑制远端肿瘤生长。体内实验表明W-TBP/CpG介导的光动力治疗与CpG运载联合抗PD-L1免疫检测点阻断疗法（W-TBP/CpG/α-PD-L1）能显著提高系统免疫响应，产生卓越的抗癌疗效。研究人员进一步检测了联合治疗后肿瘤微环境中免疫细胞的浸润情况。流式细胞术结果表明，在W-TBP/CpG/α-PD-L1联合治疗下，光动力疗法能够缓解肿瘤微环境中的免疫抑制，活化树突状细胞增强抗原递呈，免疫检测点阻断恢复耗竭性T细胞功能，针对肿瘤的系统免疫反应被重新激活，最终远端肿瘤内的T细胞数量增加，有效抑制肿瘤生长，实现远端效应。

图5. W-TBP的光动力CpG运载与免疫联合治疗。(a,b)双瘤模型上W-TBP介导的光动力疗法、树突状细胞活化与抗PD-L1免疫检测点阻断疗法联用的治疗效果。横轴为肿瘤植入后的天数，黑色、红色与蓝色箭头分别表明瘤内给药、照光与系统给抗体的时间点。(c)W-TBP/CpG/α-PD-L1治疗组中的肿瘤特异性IFN-γ 分泌细胞上调。(d-f) CD45阳性、CD4阳性T与CD8阳性T细胞在W-TBP/CpG/α-PD-L1治疗组的两端瘤中上调。

综上所述，该工作报道了一种利用阳离子金属有机框架用于免疫激活剂CpG运载、介导光动力疗法并与免疫检测点阻断疗法联合作用的新型疗法。卟啉基纳米光敏剂介导的光动力疗法可以有效杀死肿瘤细胞，释放肿瘤抗原；运载的CpG活化树突状细胞，提高了抗原递呈效率，极大增强了免疫检测点阻断疗法的疗效。

这一成果近期发表在《德国应用化学》（Angew. Chem. Int. Ed）上，文章的第一作者是芝加哥大学博士研究生倪开元。

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Nanoscale Metal-organic Frameworks Mediate Photodynamic Therapy and Deliver CpG Oligodeoxynucleotides to Enhance Antigen Presentation and Cancer Immunotherapy

Kaiyuan Ni, Taokun Luo, Guangxu Lan, August Culbert, Yang Song, Tong Wu, Xiaoming Jiang, Wenbin Lin

Angew. Chem. Int. Ed., 2019, DOI: 10.1002/anie.201911429

导师介绍

林文斌

https://www.x-mol.com/university/faculty/1445

（本稿件来自Wiley）