借助“大案牍术”，寻找影响咖啡品质的新化合物

咖啡，世界三大流行饮料之一。对于广大科研汪来说，无数跑反应、写论文、申基金的漫漫长夜，依靠的就是它了。没有一杯咖啡熬不过的科研之夜，如果有，那就再来一杯。

咖啡在科研界可不仅是热门饮料，它同样也是一个热门研究对象。从提神镇静作用机制到口感风味研究，从“咖啡环效应”到预防疾病作用等等，不一而足。当然，天然产物化学为这些作用提供了明确的化合物结构信息。那么，咖啡里面能找到结构新颖又有实际意义的化合物吗？笔者作为天然产物研究背景的科研汪，想到这个问题的第一反应是——可拉倒吧！常规的动物植物化学成分都快被研究绝了，现在天然产物研究都讲究资源要属于特殊生境，上山下海，甚至探矿，谁会花时间去挖掘平淡无奇的咖啡啊！

话不能说得太绝对，还真有“于平淡中见惊奇”的学者。美国俄亥俄州立大学食品科学与技术系的Devin Peterson教授就作了这方面的研究，不仅从咖啡中分离鉴定出新结构化合物，还发现这类化合物是咖啡风味调节剂。更妙的是，他们寻找化合物依靠的是严谨系统的数据分析方法，让笔者不禁想到近来热播电视剧《长安十二时辰》中的“大案牍术”。

图片来源：《长安十二时辰》

剧中大案牍术用来帮助靖安司办案，从大量案牍数据中去寻找合适的办案人和案情线索。与之相似，咖啡的成分复杂，所含化合物成千上万，若非依赖系统数据分析，则难以筛选分离出新化合物。

Devin Peterson教授团队研究咖啡的“大案牍术”，主体是非目标化学表征风味组学研究（Untargeted chemical profiling flavoromic analysis），此法在研究复杂的食品系统时，综合化学表征分析和食品感官信息，能够挖掘出影响食品风味特征的化学驱动因子。具体到咖啡的数据分析涉及诸多因素，主要分为：咖啡品质评价及其影响因素和化学驱动因子。

图片来源于网络

咖啡品质评价因素，包含国际精品咖啡协会（SCA）列出的10种感官指标（包括香气、酸度、咖啡体感、风味、甜度等），以cup得分方式评价。影响因素从时间上包含自农场到咖啡杯中的每一个环节，例如绿咖啡豆加工、成熟后发酵、烘焙步骤、煮咖啡工艺等，地理上的影响因素还受到咖啡品种或亚种，来源产地气候土质等因素影响。咖啡中的非挥发性化合物如蔗糖、氨基酸、酚类以及不饱和醛等化合物，都是咖啡品质的化学驱动因子。上述因素，都是本研究要考虑的内容。此外，他们在技术上还运用了液相色谱质谱联用仪（LC/MS）、多变量统计分析法（MVA）、咖啡品质重组感官评价实验、cup得分法，一并构成本文咖啡研究的现代“大案牍术”。

Devin Peterson团队首先运用非目标化学表征组学结合液相色谱质谱联用仪（LC/MS）分析咖啡样品中的化学小分子。他们选用来自亚、非、美三大洲产地的18种绿咖啡豆样品，根据国际精品咖啡协会（SCA）的Q分级认证方式和cup得分法，将样品分为3个质量等级：次品（<80）、优品（80-85）、特优品（85-90）。他们用LC/MS从这些样品煮熟的咖啡中共表征标记了2450个化学小分子。随后，他们运用多变量统计分析（MVA）建立煮咖啡化学因子与cup得分相互关系模型。多变量模型包括：主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法（OPLS）（图 1）。通过这一系列统计分析，从2450个小分子中筛选出最影响样品质量等级变化（从次品到优品直至特优品）的4个小分子：4.13_193, 7.00_437, 8.25_671, 8.52_419（化合物用LC/MS的保留时间和分子量表示，比如4.13_193表示色谱保留时间4.13 min，分子量为193的化合物）。

正交偏最小二乘法（OPLS）分析煮咖啡中化学小分子与cup得分相关性。图片来源：Food Chem.

随后，他们在多维液相色谱中富集纯化这4个化合物，进一步做煮咖啡样品的cup得分感官品质评估验证。采用重组模型分别在煮咖啡样品中定量添加4个化合物纯品，相比对照，分析其SCA认证的Q等级cup得分变化情况。结果显示，只有其中3个化合物显著增加了样品cup得分（图 2），即其感官品质增加。这3个化合物是7.00_437, 8.25_671, 8.52_419。

重组样品和对照样品的cup得分。图片来源：Food Chem.

至此，3个影响咖啡品质的化合物已经从咖啡样品纷繁复杂的多因素体系中脱颖而出。那么，“大案牍术”筛出来的到底是什么化合物？下一步，就是运用核磁共振波谱（NMR）和高分辨质谱（HRMS）鉴定出这3个化合物结构了。高分辨质谱推测分析化合物元素组成，MS/MS分析裂解片段，结合一维/二维核磁图谱解析化合物的官能团和连接方式。最后鉴定出两个化合物的结构，它们分别是3-O-caffeoyl-4-O-3-methylbutanoylquinic acid（下图左）以及3-O-caffeoyl -4-O-3–methyl butanoyl-1,5-quinide（下图右），均为新结构化合物。遗憾的是，Devin Peterson团队并没有完全解析出化合物8.25_671的结构，只是推出了部分结构片段，这给本研究留下了一个悬念。两个新化合物，是含有3-甲基丁酸酯片段（3-methylbutanoic ester moiety）的绿原酸衍生物。以往文献报道，绿原酸在食品或饮料体系中增加某些挥发性物质的水溶性，会影响食物或饮品的口感味道。

新化合物的结构

最后，他们分析了3个化合物分别在绿咖啡豆和烘焙咖啡豆中的含量水平。化合物3-O-caffeoyl-4-O-3-methylbutanoylquinic acid在绿咖啡豆中的含量比烘焙咖啡豆高大约2-3倍，这表明此化合物可能是植物代谢产物（下图）。化合物3-O-caffeoyl-4-O-3-methyl butanoyl-1,5-quinide结构只是在前者基础上脱水缩合成环，可能是咖啡豆处理过程中微生物发酵产物。化合物8.25_671的水平在绿咖啡豆和烘焙咖啡豆中没有显著相关性。

化合物3-O-caffeoyl-4-O-3-methylbutanoylquinic acid 在绿咖啡豆和烘焙咖啡豆中的相关浓度。图片来源：Food Chem.

Devin Peterson团队运用一系列现代“大案牍术”（非目标化学表征风味组学等研究方法）成功从咖啡样品中分离鉴定出能积极影响咖啡风味品质的新结构化合物。这些化合物作为咖啡风味调节因子，可以为咖啡风味鉴定分析提供帮助。化合物3-O-caffeoyl-4-O-3-methylbutanoylquinic acid在绿咖啡豆中浓度更高，统计分析显示其显著影响了咖啡品质，可作为新的咖啡品质化学标志物。该论文也为天然产物研究提供了一个有趣的范例。写到这里，笔者也看了看手中的咖啡，我为什么没有想到呢？……

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Identification of flavor modulating compounds that positively impact coffee quality

Sichaya Sittipod, Eric Schwartz, Laurianne Paravisini, Devin G. Peterson

Food Chem., 2019, DOI: 10.1016/j.foodchem.2019.125250

（本文由水村山郭供稿）