开发多硫化物敏感的GFP用于活细胞和亚细胞器中多硫化物的实时分析

多硫化物（polysulfides, HS_nH, RS_nH, n≥2; RS_nR, n≥3）是近年来发现的一类广泛存在于原核和真核细胞内的含硫化合物，在生理活动中起重要的作用，包括诱导Ca²⁺代谢流、肿瘤抑制因子磷酸化酶的调控、维持胞内的氧化还原状态等，也是线粒体功能的潜在调节因子。细胞内超过40%的蛋白通过自身的巯基化修饰参与胞内的代谢功能，而高水平的多硫化物既可以维持蛋白的过硫化修饰，又可以增强细胞的抗氧化作用。目前对于多硫化物的研究进展相对缓慢，原因之一是没有合适的可以在细胞内定位并进行实时定量多硫化物水平的方法。因此构建高效、高选择性、高灵敏性和短时间响应定量检测多硫化物的方法是人们目前亟待解决的问题。

近日，山东大学微生物技术研究院的荀鲁盈和刘怀伟团队在Analytical Chemistry上发表学术论文，首次报道了一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针，该研究通过定点突变改变绿色荧光蛋白roGFP氨基酸序列中两个半胱氨酸之间的距离从而获得荧光探针psGFP，psGFP能够特异性的检测多硫化物，并能够实现在细胞内不同细胞器的定位，实时的动态监测胞内多硫化物浓度水平的变化。

图1. 蛋白荧光探针（psGFP）的局部三维模型图

图2. 蛋白荧光探针（psGFP）对于不同样品的敏感性对比图。（a）psGFP分别和H₂S_n、DTT和H₂O₂反应后的408/488的比值差异柱状图；（b）psGFP分别和H₂S_n、DTT、GSSH和H₂O₂反应后的荧光光谱扫描曲线。

图3. 酿酒酵母体内多硫化物的分布示意图。从上到下，从左到右分别是酿酒酵母细胞质中多硫化物的分布情况；酿酒酵母线粒体的染色情况；酿酒酵母线粒体中多硫化物的分布情况；酿酒酵母过氧化物酶体的染色情况；酿酒酵母过氧化物酶体中多硫化物的分布情况。

该研究成果设计并构建了基于GFP的、多硫化物特异性的、反应可逆的比值探针，可以实时分析活细胞和亚细胞器中的多硫化物。psGFP受到ROS的干扰很小，与以前报道的多硫化物探针相比，psGFP具有明显的优势，为多硫化物在体内的研究提供了一种新方法和新思路。

胡欣和李焕杰博士为共同一作，荀鲁盈教授和刘怀伟副研究员为共同通讯作者。上述工作得到了国家自然科学基金（31770093，91751207和21477062）和山东省自然科学基金（ZR2016CM03 和 ZR2017ZB0210）的支持。

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Developing Polysulfide-Sensitive GFPs for Real-Time Analysis of Polysulfides in Live Cells and Subcellular Organelles

Xin Hu, Huanjie Li, Xi Zhang, Zhigang Chen, Rui Zhao, Ningke Hou, Jihua Liu, Luying Xun*, Huaiwei Liu*

Anal. Chem., 2019, 91, 3893–3901, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b04634