帝国理工Edel组Nat. Commun.：细数生物液体中的小分子——纳米孔光-电平台用于精确识别单个小分子标志物

从生物液体中精确定量稀有的特定生物标志物对发展早期疾病诊断工具来说是一大挑战。传统的方法如酶联免疫吸附分析（ELISA）、胶电泳以及定量PCR，虽然具有很高的灵敏度，然而其测量结果通常是平均化大量目标分子的结果，并不能反映单一分子的行为。纳米孔作为一种新的单分子测量工具正受到科学界越来越多的关注。单个分子（如DNA、蛋白质）在其之间的传输通常会反映为穿孔电流的脉冲信号。此信号的形状，大小可用于表征该特定的穿孔分子的性质（包括尺寸、带电性质等）。然而该方法对形状、性质、大小相似的分子缺乏选择性。虽然之前的工作报道过利用修饰的DNA载体特异性识别目标分子，从而从传输实验的脉冲电流二级峰来分辨分子的作用，但这种方法需要目标分子足够大才能够在载体DNA的基础上获得二级电流信号。其次，这种方法非常容易受到DNA的构象变化干扰（比如DNA折叠或者打结），从而影响其检测准确度。此外，虽然单分子荧光显微技术（如共聚焦荧光显微镜或全内反射荧光显微镜）作为传统的单分子检测手段已广泛应用，然而由于实际生物样品中存在强烈的自发荧光背景，使单个分子的荧光信号很难识别出来，极大地限制了其在生物临床样品中的应用。

为了拓展单分子技术的应用，帝国理工学院的Joshua B. Edel教授（点击查看介绍）团队于近期开发了一种新型的基于纳米孔的单分子计数光-电平台。同时结合DNA分子信标（MB）嵌入的DNA载体，将该系统用于逐个筛查实际生物样品（如人血清或者尿液）中单个小分子标志物（如低聚核苷酸oligonucleotides或者小蛋白）及其定量结合分析。当嵌有分子信标的DNA载体穿过纳米孔时，很容易观察到DNA的穿孔电流脉冲。溶液中存在的目标物寡聚核苷酸可将分子信标打开，此时在脉冲电流的位置可同时观测到一个光子爆发的光信号。计算总脉冲电流的光信号同步率即可精确定量只有十几个碱基的微小DNA。此外，该团队还用核酸适配体设计适配体信标，利用该系统检测小蛋白分子，如凝血酶。该方法可用于极其复杂的生物体系中逐一筛查单个生物小分子标志物，准确率可达99%以上，开拓了单分子技术在下一代早期临床诊断的应用。

图1. 纳米孔光-电平台的示意图及工作原理。图片来源：Nat. Commun.

该研究团队将玻璃毛细管拉出的纳米管（Nanopipette, ~20 nm）尖端与荧光共聚焦显微镜结合，构建了一个虚拟的光-电检测区域。通过YOYO-1标记的5 kbp DNA在这个区域间的电泳传输过程，他们验证了光-电信号良好的同步性质和信噪比，进一步证明了只有单一荧光团标记的DNA载体（48.5 kbp）也能高效地检测出来。在此基础上，他们应用该体系研究了带有生物素（Biotin）标记的DNA载体与单荧光团（Dylight 488）标记的链霉亲和素（Streptavidin）的相互作用，通过计数其同步光-电信号在单分子水平上识别分子的相互作用，并通过比例对其解离常数（K_d）进行估算。

图2. 单荧光团灵敏度以及结合作用的分析。图片来源：Nat. Commun.

然而在上述方式中，人们需要对分析物进行荧光标记，大大增加了样品处理过程，而且也为实际体系中的应用增加难度。该团队进一步引入分子信标（或适配体信标），并将其修饰在DNA载体上。当目标物存在时（如互补DNA或目标蛋白），分子信标打开，荧光团与淬灭基团分离，荧光被点亮，从而可以在传输实验中观察到同步的光-电信号，可用于对非标记目标物的单分子分析。他们证明了该方法对单个碱基错配或者在1,000倍以上的蛋白背景中具有非常好的选择性。

图3. 结合分子信标载体对小核酸链及蛋白进行非标记分析。图片来源：Nat. Commun.

研究团队进而测试了该体系在实际的生物液体中对单个目标物分子的响应及定量。他们发现单纯使用单分子荧光显微镜技术检测时，在生物液体中（人血清或尿液）的背景信号大大的高于在缓冲液中，为实际体系的检测带来极大的挑战。然而在该光-电平台下，背景光信号几乎保持与缓冲液中一样，具有相当高的信噪比。他们还证明该体系可以直接识别血清或者尿液中的目标分子，且不受大量的背景分子干扰，具有相当高的选择性。

图4. 对实际生物液体中的背景抑制以及对目标物的选择性识别。图片来源：Nat. Commun.

相关成果于近期发表在Nature Communications 上，文章的第一作者为帝国理工的在读博士生蔡盛林及已毕业的博士Jasmine Sze。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Small molecule electro-optical binding assay using nanopores

Shenglin Cai, Jasmine Y.Y. Sze, Aleksandar P. Ivanov, Joshua B. Edel

Nat. Commun., 2019, DOI: 10.1038/s41467-019-09476-4

导师介绍

Joshua B. Edel

https://www.x-mol.com/university/faculty/2481

课题组链接

https://www.imperial.ac.uk/edel-group