定量蛋白质组学中二甲基化标记的副反应

近年来，能够同时对细胞、组织中的蛋白质组进行定性、定量研究的定量蛋白质组学在生物医学研究中的重要性与日俱增。根据是否对所分析的样品进行标记，定量蛋白质组学可分为“非标定量”和“同位素标记定量”这两大策略。鉴于标记定量的定量准确性普遍高于非标定量，标记定量在对定量准确度有较高要求的实验中被更广泛采用。

根据标记方式的不同，又可分为化学标记、代谢标记、酶解标记三种方式。其中,化学标记法因适用范围广泛、可同时标记的样品组数较多、实验简单等优点，成为当前定量蛋白质组学中使用最广泛的标记方法。

常用的化学标记定量方法包括，二甲基化、iTRAQ、TMT等，其中二甲基化标记因其良好的标记效率、简便的实验过程、低廉的试剂成本而受到研究人员的喜爱，是当前定量蛋白质组学领域最常用的化学标记技术之一。

虽然之前人们普遍认为二甲基化标记反应具有很高的反应效率和反应选择性，文献里也很少有其副反应的报道，但事实上，二甲基标记反应并非真如人们以为的那样“高特异性”，只是副反应及其产物在目前的技术手段下很难被发现罢了：蛋白质组学的标记样品通常非常复杂（一般含有数万种序列各异的肽段），在这样复杂的组成中，副产物即使能被LC-MS/MS检测到，在基于数据库检索的鉴定分析中，由于缺乏副产物的相关信息（例如修饰发生位置及分子量变化），导致搜索引擎无法识别副产物谱图，所以即使发生了严重副反应，也无法发现。

上海交通大学医学院廖日晶实验室按照常规试验方法使用甲醛、硼氢化钠对合成肽段（DRVYIHPF）进行二甲基标记，再用LC-MS/MS分析标记产物时发现：除了正常的二甲基标记产物，还产生了一个比原始肽段分子量增加26 Da的次要产物（图1a），二级质谱分析显示该+26 Da的修饰发生于N端氨基酸（图1b），但是具体结构尚不清楚。随后该团队通过实验发现该副反应并无氨基酸偏好性，可广泛发生于蛋白质组的各种肽段的N端。

图1. a）LC-MS分析肽段DRVYIHPF的二甲基标记产物；b）副产物的二级质谱图

为了研究该副反应所形成的修饰基团的化学结构，该团队分离纯化了合成肽段LVNE的二甲基化标记副产物。经核磁共振（NMR）鉴定，该副产物在第一和第二个氨基酸之间形成了一个N-甲基-4-咪唑啉酮结构（图2）。

图2. NMR鉴定肽段LVNE的二甲基标记副产物的化学结构

该结构提示，该副反应和二甲基化反应都经历了共同的中间体：亚胺。如果亚胺中间体不能及时被还原剂还原，就可能与临位的酰胺发生交联，生成副产物（图3）。

图3. 二甲基标记反应和副反应的化学机制

上述副反应的形成机制表明，提高还原剂的还原能力可以抑制该副反应。于是，该团队通过改变试剂加入顺序、增加硼氢化钠浓度、降低溶液pH值等手段，来抑制该副反应。他们在常规标记条件和优化标记条件下分别对HeLa蛋白质组样品进行了二甲基化标记，两种条件下的分析结果表明：使用优化条件标记的样品中，副反应的发生几率显著降低，更重要的是，二甲基化标记肽段的鉴定谱图数（PSMs）、肽段数和蛋白数都得到显著提高（图4），证明了他们优化后的标记方法不仅能有效抑制副反应的发生，还能有效提高二甲基化标记定量蛋白质组的鉴定效率和覆盖深度。

图4. 传统或优化的条件下标记HeLa蛋白质组酶解产物的副产物鉴定数（side products）、正确标记产物的谱图鉴定数（PSMs）、肽段数（unique peptides）和蛋白数（grouped proteins）。

这一成果发表在近期的Analytical Chemistry 上，廖日晶博士是文章的第一兼通讯作者。

该论文作者为：Rijing Liao , Yuan Gao, Ming Chen, Lulu Li, Xuye Hu

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

A Ubiquitous but Overlooked Side Reaction in Dimethyl Labeling of Peptides

Anal. Chem., 2018, 90, 13533-13540, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b03570

廖日晶博士简介

廖日晶，上海交大医学院副研究员。2011年于中科院上海有机化学研究所取得博士学位，现担任上海交大医学院精准医学研究院蛋白质组学平台主任。