Chem. Sci.：纳米反应器，水性条件下做Suzuki偶联和去炔丙基化

生物正交反应（bioorthogonal reaction）是2003年提出的概念，指的是可在活体细胞、组织中高效特异进行并且与生命过程中的生化反应互不干扰的外源化学反应。在过去十数年中，生物正交反应已成为化学生物学的重要工具，帮助科学家更好地研究和理解不同的生物过程，一系列生物正交反应被广泛应用于蛋白质修饰、高通量测序、细胞或亚细胞结构选择性标记、蛋白质组学等领域。钯（Pd）是常用的催化剂，大量的研究集中于有机溶剂存在下的反应，而在生物系统的水性环境中，特别是在含有较高浓度生物分子组分的复杂水性环境中，Pd催化剂容易失活，在生物正交反应中的应用受到很大限制。有些化学家使用Pd纳米颗粒作为催化剂，在水环境中实现了诸如铃木-宫浦交叉偶联（Suzuki-Miyaura cross coupling）等反应。不过此类反应一般需要外源碱，反应温度也高于50 ℃，此外Pd纳米颗粒容易聚集也容易失活，要求随制随用（30 s内），这些限制对于生物系统来说都过于苛刻。因此，开发能在生物介质中正常工作的Pd纳米催化结构，是当前的主要挑战。

在这种背景下，包括Fernando López、Miguel A. Correa-Duarte、José L. Mascareñas等研究者在内的一个西班牙团队最近在Chemical Science 杂志报道了一种基于中空纳米反应器的生物正交钯多相催化新策略。具体而言，这种纳米反应器由介孔二氧化硅中空纳米壳和均匀分布在壳层内表面上的钯纳米颗粒组成。通过合理调节壳层的厚度和孔隙率，低分子量反应物和产物可有效流动，同时还可避免金属泄漏并阻止有可能钝化催化表面的大生物分子的进入。在生理温度范围内，这种中空纳米反应器可在水性介质中促进Suzuki-Miyaura交叉偶联以及断裂O-炔丙基的去炔丙基化反应。更重要的是，即使在相对高浓度的生物分子组分存在下，甚至在哺乳动物细胞存在下，该中空纳米反应器也能完成生物正交去炔丙基化反应。

生物相容性中空纳米反应器。图片来源：Chem. Sci.

这种中空纳米反应器的制备并不复杂。先在用作牺牲模板的均相聚苯乙烯（PS）微粒上沉积Pd纳米颗粒（3.8±0.5 nm），随后涂覆均匀介孔二氧化硅层，再在温和条件下除去PS模板，就可得到内表面上修饰有Pd纳米颗粒的介孔二氧化硅中空纳米壳（壳层厚度约25 nm）作为纳米反应器（记为Pd-Cap1，平均尺寸约500 nm）。研究者对所得中空纳米反应器进行了一系列表征，Pd纳米颗粒均匀分布在二氧化硅壳层内表面，Pd负载量为 0.61 μg/mg。此外，稳定性测试表明，在37 ℃水溶液中Pd-Cap1可保持稳定至少30天，内表面上的Pd纳米颗粒没有任何明显变化。

中空纳米反应器的制备示意图。图片来源：Chem. Sci.

中空纳米反应器Pd-Cap1的表征。图片来源：Chem. Sci.

研究者使用炔丙基酚衍生物1的去炔丙基化反应来测试Pd-Cap1的催化活性。炔丙基酚衍生物1在脱去炔丙基保护基后，产生发绿色荧光的苯并噻唑产物2，于是就能够在μM的低浓度级别有效量化反应产率。在DMSO与水混合物（2:8）中用Pd-Cap1（Pd含量5 mol%）处理1（50 μM），在37℃下3小时后得到产物2，产率32%。而不加Pd-Cap1的情况下，反应不发生。提高Pd-Cap1的浓度以及延长反应时间，可以提高产率。用常规的Pd纳米颗粒作为催化剂，相同条件下反应24小时后产率则低于10%，这证明了中空纳米反应器的确可以保护Pd纳米颗粒的催化活性。随后，研究者又用水溶性更好的苯乙烯基吲哚鎓探针3进行了活性测试，用Pd-Cap1（Pd含量10 mol%）处理3的水溶液，在37℃下24小时后，去炔丙基化产物4的产率为47%，如果反应时间延长到48小时，产率可升至73%。将水替换成PBS缓冲液，Pd-Cap1的活性几乎没有明显变化。

Pd-Cap1参与去炔丙基化反应。图片来源：Chem. Sci.

随后，研究者尝试了更具挑战性的双分子过程，测试了Pd-Cap1促进的2-噻吩基硼酸（5）和对碘苯甲醛（6）的Suzuki-Miyaura交叉偶联反应，产物4-（噻吩-2-基）苯甲醛（7）具有强烈的蓝色荧光。在碱存在下，反应物水悬浮液在37°C下反应24小时，7的产率可达78%。尽管没有碱的情况下上述反应不会发生，但让人惊喜的是，如果用PBS 10X（pH 7.2）作为溶剂，无需外加碱也可进行反应，37℃下反应24小时，产率为86%。这是中空钯纳米反应器首次应用于生理温度下、水性溶剂中的Suzuki-Miyaura交叉偶联反应。

Pd-Cap1参与Suzuki偶联反应。图片来源：Chem. Sci.

随后，研究者开始试验将上述反应应用到含有生物分子的水性反应体系，以测试该方法的生物正交性。令人欣慰的是，Pd-Cap1促进的5与6的Suzuki-Miyaura交叉偶联反应在碳水化合物（例如葡萄糖）、氨基酸（例如甘氨酸、酪氨酸、缬氨酸）的存在下，产率几乎没有变化。然而，遗憾的是，该反应会被硫醇类生物分子（例如谷胱甘肽）抑制，并且在细胞裂解物中或在Vero细胞存在下也无法进行。这种失活可能与双分子过程更复杂的机制以及钯中间体和一些生物分子（特别是与硫醇）的反应有关。相比之下，Pd-Cap1促进的探针3的去炔丙基化反应在葡萄糖、氨基酸、甚至谷胱甘肽存在下都能进行，而且该反应在5.3和4.5的酸性pH下也不受明显影响。此外，该反应在高浓度蛋白质（如BSA，高达600 μM）存在下也能进行，这对其他Pd配合物催化剂来说是“不可能完成的任务”。

生物分子对Pd-Cap1参与的Suzuki偶联反应的影响。图片来源：Chem. Sci.

生物分子对Pd-Cap1参与的去炔丙基化反应的影响。图片来源：Chem. Sci.

细胞毒性的初步分析显示，中空纳米反应器Pd-Cap1比已报道的Pd配合物催化剂生物相容性更好，在20 μM下细胞生存率仍高于75%。基于此，研究者进行了细胞环境中的催化活性测试。他们在Vero哺乳动物细胞的存在下进行了Pd-Cap1参与的探针HBTPQ（8）的去炔丙基化反应。在UV光照射下，HBTPQ不会发出红色荧光，但其去炔丙基化产物HBTP（9）可产生红色荧光。在该实验中，细胞外培养基用含50 μM的BHTPQ溶液代替，加入Pd-Cap1达到最终Pd浓度为5 μM，并通过共聚焦显微镜监测细胞荧光。结果显示，在用HBTPQ孵育的细胞中观察到由细胞内的产物引起的红色荧光斑点。这表明，中空纳米反应器Pd-Cap1在细胞存在下一样可以促进去炔丙基化反应的进行。

动物细胞存在下Pd-Cap1参与的去炔丙基化反应。图片来源：Chem. Sci.

——小结——

本文采用简单方法构建了内表面上修饰有Pd纳米颗粒的介孔二氧化硅中空纳米壳，作为中空纳米反应器在生物相容的水性反应体系和温度条件下促进Pd催化的去炔丙基化以及Suzuki-Miyaura交叉偶联反应。这种中空纳米反应器稳定性好，可通过调节二氧化硅壳层厚度以及孔隙率来控制反应。在相对高浓度的生物分子存在下，甚至在动物细胞存在下，这种中空纳米反应器依然能促进去炔丙基化反应的进行。尽管产率和反应速率只能算中等，但这种可用于生物正交反应的策略还是有着广阔的应用前景，例如蛋白质分子的标记、基于前药活化的新疗法、生物相容的非天然代谢网络的构建等等。

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Hollow Nanoreactors for Pd-catalyzed Suzuki-Miyaura Couplings and O-Propargyl Cleavage Reactions in Bio-relevant Aqueous Media

Chem. Sci., 2019, DOI: 10.1039/C8SC04390F

（本文由甘棠供稿）

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