具有局域加速能力的脱氧核酶荧光探针用于细胞内miRNA的高灵敏检测

microRNA（miRNA）又称小RNA，主要存在于细胞质中，长约19-23个核苷酸，它可以通过降解mRNA或抑制蛋白质的翻译，实现在基因水平上对生物的生长发育及凋亡进行调控。大量研究表明，miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。因此，发展高灵敏的miRNA原位检测方法对于疾病的早期诊断、预后评估及相关生物学功能的研究具有重要的意义。然而，由于细胞内环境复杂，传统的探针因其生物稳定性差、响应时间长且灵敏度较差，难以实现对活细胞中低丰度miRNA的高灵敏、快速和原位检测。

DNAzyme（脱氧核酶）是一段具有类似于蛋白酶催化活性的DNA片段，具有水溶性好、生物相容性好、易修饰、化学稳定性好等优点。因此，基于脱氧核酶的信号放大技术在miRNA检测领域引起了越来越广泛的关注。然而，脱氧核酶在检测细胞内的miRNA时，存在以下缺陷：脱氧核酶及其底物很难自主穿过细胞膜进入活细胞，进入细胞效率较低；脱氧核酶的动力学依赖于游离脱氧核酶和底物的自由扩散，且速度相对缓慢（约几个小时）；脱氧核酶易被细胞内的核酶降解。

针对上述问题，郑州大学屈凌波教授课题组设计了一种具有局域加速能力的脱氧核酶荧光探针（Accelerated-DzFN）用于细胞内疾病相关miRNA的检测。设计原理如图1所示，首先以两条DNA长链（A1和A2）为基本单元通过碱基互补配对原则构建了一条线状DNA纳米骨架，然后将一对能发生脱氧核酶催化的发夹探针（H1和H2）交替有序地固定在DNA纳米骨架上得到了脱氧核酶纳米探针。该纳米探针可以通过内吞作用进入细胞，从而提高脱氧核酶进入细胞的效率；另外，由于脱氧核酶与底物被组装在线状纳米结构上，使得探针在一定空间内的浓度大大提升，从而提高了探针检测的灵敏度并且缩短了反应时间；再次，纳米结构具有较强的抗核酶降解能力，大大提高了探针的生物稳定性，避免了假阳性信号的产生。同时，作者通过巧妙的设计，使得目标miRNA可以循环多次使用，可连续切割多条底物链，最终实现了对miRNA的进一步放大检测。通过细胞实验，作者证明了该探针可以实现对细胞内低丰度目标miRNA-21的高灵敏、高特异性快速成像检测，且成功用于区分正常细胞和癌细胞，在疾病诊断、预后评估、生物医学研究等领域展现出潜在的应用前景。

图1. 具有局域加速能力的脱氧核酶荧光探针用于细胞内miRNA检测的原理图。

这一成果近期发表在Chemical Communications 上，郑州大学博士生吴亚楠为文章的第一作者，李朝辉教授、孟红敏副教授和屈凌波教授为文章的共同通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金（(21605038, 21974125）的资助。

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Accelerated DNAzyme-based fluorescent nanoprobe for highly sensitive microRNA detection in live cells

Yanan Wu, Hongmin Meng, Juan Chen, Kemei Jiang, Ran Yang, Yingying Li, Ke Zhang, Lingbo Qu, Xiaobing Zhang, Zhaohui Li

Chem. Commun., 2020, 56, 470-473, DOI: 10.1039/C9CC08598J