半三明治铱和钌配合物：细胞中的有效追踪和抗癌诊疗试剂的研究

由于一些铂类抗癌药物如顺铂、卡铂和奥沙利铂在临床上使用取得巨大的成功，同时随着铂类抗癌药物在临床的广泛使用，使用后出现的一些副作用例如毒副作用和铂耐药性又限制了其进一步的应用。新型非铂类抗癌药物的设计和发现因而受到极大地关注。非铂金属介导的抗癌药物已被证明在癌症化疗中具有巨大的潜力，已经在癌症治疗药物中受到的广泛关注，尤其是金属铱及钌。最近，刘哲（点击查看介绍）团队对于环戊二烯基有机铱抗癌复合物的开发，发现其不仅显示出对包括铂类药物抗性癌细胞系在内的各种癌细胞系的高效力，而且还显示出新的作用机制。然而，这些配合物大多数仍然存在不确定的目标靶向和作用机制。金属复合物的成像能力在研究细胞中的分子成像起着关键作用，有助于了解它们在许多重要细胞过程中的作用机制。环金属化的铱或钌配合物由于其强烈的发射，长的发射寿命，大的斯托克斯位移和高的光稳定性而被发现作为生物和化学成像剂和探针的极好用途。然而半三明治金属抗癌配合物的本身的荧光特性有待进一步研究。荧光抗癌复合物的设计和开发具有重要意义。配合物的发光特性可以帮助研究人员实时跟踪药物在细胞内转运和分布，并监测药物与生物靶分子之间的相互作用，从而为揭示抗癌药物作用机制提供重要的研究工具。

近日，刘哲教授课题组涉及合成了具有亚氨-三苯基吡啶配体的半三明治金属配合物（图1）。亚氨-三苯基吡啶配体是具有多个苯环的配体可以提高半三明治金属配合物的细胞内成像能力和抗癌活性；芳基取代的亚氨基吡啶金属配合物显示出高催化活性和高立体选择性. 刘哲教授课题组通过共聚焦显微镜观察了活细胞中半三明治铱和钌配合物的观察结果，这将为研究半三明治型金属抗癌复合物的作用机理提供新的研究方法。并利用共聚焦显微镜和ICP-MS研究了这些配合物在癌细胞中的毒性和细胞分布和摄取。通过研究它们的水解、稳定性、核碱基结合、DNA相互作用、BSA相互作用、催化氢转移分析、核形态变化、细胞周期和细胞周期蛋白、ROS、细胞凋亡和线粒体膜电位变化，了解半三明治金属配合物的作用机制。结果表明，这类金属配合物在癌症化疗中具有很大的潜力。半三明治铱和钌抗癌配合物整合了高抗癌活性和发光性质等优点为构建新型治疗诊断平台提供了机会。

图1： 在该工作中研究的有机金属IrIII环戊二烯基[(η⁵-Cp^x)Ir(N^N)Cl]PF₆和Ru^II芳烃[(η⁶-area)Ru(N^N)Cl]PF₆配合物。

刘哲教授团队通过使用共聚焦显微镜检测配合物在A549细胞中成像效果。在λ_ex= 405 nm处观察到配合物1和3的清晰的共聚焦显微镜图像。使用共聚焦显微镜图像使配合物发射蓝光，这提供了研究其细胞定位的机会（图2）。图像清楚地表明，复合物1和3可以有效地渗透到A549细胞中，并且这些复合物的大量细胞摄取在A549细胞处理的0.5小时内发生。有趣的是，根据配合物1和3与线粒体染色染料MTDR（MitoTracker Deep Red）的双重染色，发现复合物3可以在一定程度上定位在线粒体中（Overlay，图2），其Pearson共定位系数（PCC）0.61，然而，配合物1在孵育30分钟后有效地渗透到细胞核中。同时利用LTDR（Lyso Tracker Deep Red）研究了配合物3与溶酶体的共定位。结果显示配合物3能够在A549细胞中特异性染色溶酶体。然而，与线粒体的共定位相比，配合物3与溶酶体染料观察到较少的重叠，PCC为0.49。这说明配合物3更倾向于富集在线粒体。配合物1对BSA和ctDNA具有一定的结合能力，表明该复合物具有结合蛋白质和DNA的能力。此外，复合物1具有强亲脂性。复合物1选择性染色细胞核的原因可能与与组氨酸或富含组氨酸的蛋白质的反应，和核区域中堆积的核酸碱基对之间的插入有关。

配合物1和3含有相同的N,N-螯合配体和总电荷，然而，它们在细胞中显示出完全不同的定位特异性，表明金属和芳烃/环戊二烯基配体在选择细胞器细胞定位中起关键作用。

图2：（A）通过共聚焦显微镜用MTDR测定1或3的定位。 将A549细胞与1或3（10 μM，0.5小时）一起温育，然后在37 ℃下用MTDR（100 nM，0.5小时）染色。 （B）用LTDR暴露于3的A549细胞的共聚焦图像。 将A549细胞与3（10 μM，0.5小时）一起温育，然后在37 ℃下用LTDR（100 nM，0.5小时）染色。 配合物的激发和发射带：λ_ex= 405 nm，λ_em= 460±30 nm; 对于MTDR：λ_ex= 644 nm，λ_em= 700±30 nm; 对于LTDR：λ_ex= 594 nm，λ_em = 630±30 nm。 比例尺：20 μm。 （C）暴露于10 μM 1或3后24小时后A549细胞的细胞质，细胞核和细胞骨架部分（Ir / Ru ng / 10⁶ 细胞）的铱/钌含量。

刘哲教授团队研究了配合物诱导细胞凋亡可能的机理。线粒体功能的损害在外在和内在细胞凋亡中起重要作用，例如线粒体膜电位（MMP）的丧失。1和3使线粒体膜去极化的细胞百分比分别从6.9%增加到82.0%和62.0%（图3），MMP的减少是细胞凋亡的早期表现。一旦线粒体膜电位丧失，细胞就会进入不可逆的凋亡阶段。配合物1可以穿透细胞膜，进入细胞并靶向细胞核。细胞核是细胞中最大的细胞器，也是细胞内所有活动的控制中心。它可以调节线粒体的功能，如线粒体膜通透性和细胞色素C释放。为了探索细胞毒性和线粒体膜电位之间的关系，使用环孢菌素A（CsA，线粒体通透性转换孔的脱敏剂）。在CsA存在下，复合物1的细胞毒性降低，表明MMP的降低可以增加细胞毒性。

图3：（A）复合物1和（B）复合物3对通过JC-1染色和流式细胞术分析的MMP的影响。 用指定浓度的载体或复合物处理A549细胞24小时。

活性氧物质（ROS）在调节细胞增殖，死亡和信号传导中非常重要。过量产生ROS通常是抗癌药物的重要MoA。当A549癌细胞暴露于1和3之后24小时，观察到癌细胞中ROS水平以剂量依赖性方式明显升高（图4）。由于配合物可以催化氢化物从NADH转移到氧气中，产生ROS H₂O₂作为产物。因此，刘哲教授团队测试了H₂O₂是否在细胞中产生。实验结果表明，1和3处理的A549癌细胞中H₂O₂含量在0.25×IC₅₀时明显增加。

药物诱导癌细胞凋亡的能力取决于产生ROS的能力。为了探测1和3产生的ROS对诱导的细胞凋亡和细胞毒性的影响。在癌细胞加入1或3之前使用ROS清除剂NAC（N-乙酰基-L-半胱氨酸）。结果显示NAC处理的细胞显示较高的细胞活力和较低的细胞毒性，这表明NAC的存在明显保护细胞免受1和3的攻击。因此显示了ROS在1和3诱导的细胞凋亡和细胞毒性中的关键作用。

图4：用流式细胞术分析指定浓度的配合物1和3处理24小时的A549癌细胞中诱导产生的ROS。

接下来，刘哲教授团队研究了细胞周期停滞是否是抑制癌细胞增殖的结果。通过流式细胞术，分析了用2×IC₅₀的配合物1和3暴露24小时后A549癌细胞的细胞周期进展。当细胞暴露于配合物3时，细胞周期的G₀/G₁期细胞百分比增加10.4％，表明该复合物使细胞周期停滞在G₀/G₁期；然而，对于配合物1没有观察到显着变化。当细胞在G₀/G₁期时进行准备DNA合成，配合物3可能通过与核酸碱基相互作用而在一定程度上阻止RNA合成从而使细胞周期阻滞在G₀/G₁期。

为了研究周期改变的方式，作者检查了药物暴露后细胞周期蛋白的变化。CDK4（细胞周期蛋白依赖性激酶4）通过形成CDK4-细胞周期蛋白D1（cyclin D1）复合物在G₀/G₁期中是必需的。CDK4 / cyclin D1的失活与G₀/G₁期阻滞有关。如图5B所示，检测到CDK4和cyclin D1的积累减少，表明复合物3通过灭活CDK4和cyclin D1诱导G₀/G₁期阻滞。

作者进一步研究了细胞周期的变化是否与ROS相关，在NAC存在下进行细胞周期测定。与没有NAC的细胞周期结果相比，NAC预处理的细胞G₀/G₁期没有发生改变，CDK4 /cyclin D1水平的变化也不明显。因此，在这次实验中ROS可能对于细胞周期的变化没有影响。对于复合物1，细胞周期停滞不是抑制癌细胞增殖的主要原因，它通过ROS依赖的线粒体途径引起细胞凋亡。然而，这些细胞周期紊乱可能有助于复合物3诱导的细胞凋亡。

图5： A549癌细胞的细胞周期分析结果。使用PI进行流式细胞术的细胞染色。 （A）用于对照的每个细胞周期阶段的细胞群和在2×IC₅₀的复合物1和3以及用10mM NAC预处理1小时的细胞然后用复合物3处理24小时。 （B）通过流式细胞术测量暴露于配合物3 之后24小时的CDK4 /细胞周期蛋白D1水平的变化。

——小结——

这项工作证明了半三明治金属抗癌复合物可以使用共聚焦显微镜非常容易的进行细胞内观察。有助于进项细胞机制的理解，包括细胞摄取、分布和与生物靶标的相互作用。Ir复合物1和Ru复合物3通过共聚焦显微镜在细胞中追踪，首先用于确定细胞中的生物分布并促进其在体内的研究。作者发现细微的结构变化会对细胞毒性和细胞定位产生很大影响。线粒体膜电位（MMP）的丧失和ROS的过量产生在内在细胞凋亡中起重要作用。此外，复合物3灭活CDK4 / cyclin D1并在G₀/G₁期停滞细胞周期。这项工作为追踪和监测细胞中半三明治金属复合物，及了解它们的作用机制和提高的方法铺平了道路。并证明了半三明治金属配合物作为诊疗试剂的潜在应用。

这一成果发表在Inorganic Chemistry 上，第一作者是李娟娟，通讯作者是刘哲教授。

该论文作者为：JuanJuan Li, Lihua Guo, Zhenzhen Tian, Shumiao Zhang, Zhishan Xu, Yali Han, Ruixia Li,Yan Li, Zhe Liu*

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Half-Sandwich Iridium and Ruthenium Complexes: Effective Tracking in Cells and Anticancer Studies

Inorg. Chem., 2018, 57, 13552−13563, DOI: 10.1021/acs.inorgchem.8b02161

刘哲教授简介

刘哲教授，山东省“泰山学者海外特聘专家”，山东师范大学博士生导师，济南大学客座教授，博士后指导教师，英国皇家化学会会员，国际生物无机化学会会员，中国化学会会员。承担国家自然科学基金、省泰山学者基金等多项基金。多次受邀为ACS、RSC、Elsevier、Springer等国际出版社旗下的众多刊物审稿。

刘哲教授课题组致力于抗癌药物的开发与诊疗的研究。代表性论文包括Acc. Chem. Res.（IF = 20.833，他引120余次）1篇, Angew. Chem. Int. Ed.（IF = 13.734，一篇被评为VIP文章）4篇, J. Med. Chem.（IF = 5.614，他引120余次）1篇。海外期间作为第一完成人参与国际科研项目四项，其中重大项目两项（European Research Council, Swiss National Science Foundation，科研经费156.5万欧元和25万瑞士法郎）。

https://www.x-mol.com/university/faculty/21161