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通过氯代喹喔啉与邻二硫酚反应实现生物正交连接与剪切

生物正交反应在生物分子的标记和功能调控等方面具有重要应用,但由于生物体系的复杂性,在众多的化学反应中,具有生物兼容性、并能够用于复杂生物体系研究的生物正交反应非常有限。因此,开发新型、高效的生物正交反应是化学生物学研究人员的一项重要任务和挑战。近年来,已开发出了一些生物正交连接反应,最具有代表性的生物正交反应有铜(I)催化的有机叠氮化物与端炔的环加成反应(CuAAC)、环张力驱动的有机叠氮化物与八元环内部炔基的环加成反应(SPAAC)、四嗪与反式环辛烯的反电子Diels‒Alder反应(IEEDA)。生物正交剪切反应也受到了关注,一些基于酸、亲核试剂、氧化剂、还原剂、过渡金属促进或光诱导的可剪切反应被陆续开发出来,但它们的剪切条件通常相对苛刻,因此限制了它们在生物体系中的应用。另外,在一个生物反应体系中,能够同时实现生物正交连接和生物正交剪切的更为稀少。


近日,清华大学化学系付华教授(点击查看介绍)团队提出了一种全新的生物正交连接与剪切方法,该方法通过氯代喹喔啉 (Chloroquinoxalines, CQ) 与邻二硫酚 (ortho-Dithiophenols, DT) 的双亲核取代反应实现生物正交连接与剪切 (图1)。这种CQ-DT正交反应通过两个非天然基团自发进行,具有反应底物简单易得、生物兼容性好、良好的动力学特性,同时反应偶联物具有较强的荧光性质。因此,该方法可用于生物正交连接,生物正交剪切以及蛋白分子的标签转换等,为蛋白修饰、蛋白捕获和凝胶内荧光分析发展了一条新途径。

图1. 生物正交连接与剪切策略


作者首先在有机溶剂、有机溶剂与水的混合溶剂以及PBS缓冲溶液中对小分子偶联反应进行了探索,并对反应底物的兼容性,反应的动力学特性以及荧光特性进行了研究,证明该反应具有发展成为生物正交反应的潜力。同时作者对二氯喹喔啉与邻二硫酚进行修饰,通过一条连接臂将其与马来酰亚胺基团连接,利用马来酰亚胺与巯基的特异性反应,在谷胱甘肽 (GSH) 上验证了偶联反应的可行性。


蛋白是一种重要的生物聚合物,其化学修饰可为生物学和医学研究提供多种用途,如生物素修饰,荧光标记等。在小分子研究基础上,作者利用模型蛋白检验了上述CQ-DT反应 (图2),以确定其作为新型生物正交反应的潜力。作为模型蛋白,作者选择了蛋白C2A (S83C),该蛋白具有单个表面暴露的半胱氨酸残基,以方便对其进行修饰与检测。在PBS缓冲溶液中,在蛋白上引入二氯喹喔啉基团,然后将其与带有生物素、荧光素或多肽的二硫酚偶联,并采用HPLC、ESI-MS和SDS-PAGE检测其连接效率。实验结果表明,在PBS缓冲溶液中,该生物正交反应用于对蛋白修饰时,表现出了几乎定量的连接效率。

图2. 利用CQ-DT反应实现蛋白的生物正交连接


此外,为了检测这种CQ-DT反应在更为复杂体系中的反应效率,作者在细胞裂解液和含血清细胞培养基中对蛋白进行了生物正交反应实验 (图3)。实验结果表明,无论是在细胞裂解液还是在含血清细胞培养基中,反应都能顺利进行。即使事先将带有二氯喹喔啉正交基团的蛋白在细胞裂解液或含血清细胞培养基中孵育一段时间,然后再进行偶联反应,与在PBS缓冲液中反应相比,转化率仍能保持在80%以上。

图3. 在细胞裂解液或含血清细胞培养基中实现蛋白的生物正交连接


最后,为了进一步调查这种CQ-DT反应可同时作为生物正交连接和生物正交剪切的可行性,作者设计、合成了三条生物正交反应链,这三条链通过不同的连接臂与生物素相连,随后通过迈克尔加成反应将其与蛋白偶联,利用该偶联修饰蛋白,检测生物正交连接和生物正交剪切的效率 (图4)。实验结果表明,所设计的三条链均可在邻二硫酚作用下顺利实现了生物正交连接和生物正交剪切。这种生物正交反应在释放出小分子的同时,使蛋白带上荧光基团,利用自身荧光特性实现了对蛋白的标记。因此,该方法还可用于蛋白的捕获与释放,轻松实现蛋白分子所带标签的转换。

图4. 利用CQ-DT反应同时实现了生物正交连接与剪切


这项工作近期发表在Angew. Chem. Int. Ed. 上,文章的第一作者是清华大学化学系博士生李友山,通讯作者是付华教授。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Both Bioorthogonal Ligations and Cleavages via Reactions of Chloroquinoxalines with ortho-Dithiophenols

Youshan Li, Zhenbang Lou, Hongyun Li, Haijun Yang, Yufen Zhao, Hua Fu*

Angew. Chem. Int. Ed., 2019, DOI: 10.1002/anie.201913620


付华教授简介


付华,清华大学化学系教授,博士生导师。1989年本科毕业于武汉大学,1998年获清华大学博士学位,并获教育部全国优秀博士学位论文奖。2000年至2002年在美国俄亥俄州立大学化学系,从事博士后研究工作。1999年至今,先后任清华大学化学系讲师、副教授、教授。2005年入选教育部“新世纪优秀人才支持计划”。该课题组目前研究方向包括:光催化的有机反应、不对称合成、化学生物学。迄今为止,在J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Org. Lett.、Chem. Commun.、J. Org. Chem.等学术期刊上发表论文220余篇。


https://www.x-mol.com/university/faculty/11992


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(所有图片均来源于作者课题组)


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