定量化学蛋白质组学新策略

化学蛋白质组学主要是利用基于生物活性小分子结构的化学分子探针探测与蛋白质组的相互作用，从而揭示小分子在细胞内的靶标蛋白相互作用，并研究其在生理、病理以及药理过程中发挥的功能。目前应用最广泛的化学蛋白质组学的方法是基于活性的蛋白质组分析技术（activity-based protein profiling, ABPP），利用活性探针共价连接某些蛋白中的高活性氨基酸位点，进一步利用探针中的报告基团进行富集，用于凝胶电泳分析或用质谱对蛋白信息进行鉴定。2010年，Weerapana等人将ABPP、串联正交水解技术（tandem orthogonal proteolysis, TOP）及定量蛋白质组学中ICAT技术的概念相结合，发展了isoTOP-ABPP技术，从而可以在位点的层面上对生物小分子的结合进行定量检测和分析。但由于在该方法中同位素氨基酸试剂价格高昂以及可切割轻重标签试剂的合成冗长、产率较低，该方法的应用受到了限制。

近日，北京大学化学分子工程学院的王初研究员（点击查看介绍）团队首次将基于同位素的二甲基化标记法与TOP-ABPP技术相结合，规避昂贵的氨基酸试剂以及复杂的化学合成，发展了一种容易获得、经济，并且与多种商业化可切割标签兼容，同时可以实现三重标记定量化学蛋白质的方法rdTOP-ABPP。

在该方法中，经过探针共价标记、生物正交反应、生物素富集以及串联切割后，含有探针标记的肽段被轻、中、重三种同位素标记的甲醛试剂标记并被氰基硼氢化钠还原，实现了对肽段中N端和赖氨酸侧链残基中氨基基团的同位素二甲基化标记，在通过高分辨液质联用仪对样品分析后，可以通过实验室开发的CIMAGE软件进行三重定量数据的分析。完成了对rdTOP-ABPP方法的建立和优化后，作者首先将该方法与isoTOP-ABPP在实际案例进行了直接的比较。Wang等人在2014年利用competitive isoTOP-ABPP策略定量分析了全细胞中脂源性亲电小分子HNE的修饰半胱氨酸位点，但为了比较不同浓度下修饰水平的变化，作者需要将只有二重定量能力的isoTOP-ABPP实验进行两次平行的操作，最后取二者的交集，费时费力而且造成数据的丢失。而完成同样的分析，作者只需要操作rdTOP-ABPP一次，就可以实现DMSO、10 μM、50 μM三种不同处理条件下修饰位点的准确定量。数据分析表明，rdTOP-ABPP的定量结果不仅与competitive isoTOP-ABPP具有较好的重叠（例如RTN4中的第1111位，EEF2中第41位，FN3KRP中第24位等HNE高活性的半胱氨酸位点都能通过两种方法鉴定），而且rdTOP-ABPP可鉴定许多额外的全新位点（HMOX2的第282位半胱氨酸与VDAC2的第210位半胱氨酸）。这一结果说明rdTOP-ABPP具有与isoTOP-ABPP类似甚至更好的分析能力，同时避免了isoTOP-ABPP对价格昂贵、合成冗余的同位素标记生物素探针的依赖。

rdTOP-ABPP除了可以实现对浓度梯度的化合物修饰进行鉴定之外，还可以进一步应用于对构型选择性的化合物修饰进行鉴定。作者利用rdTOP-ABPP鉴定细胞铁死亡诱导剂RSL3对半胱氨酸的修饰对这一方面的应用进行了展示。铁死亡是在2012年定义的一种新的细胞死亡方式，这种死亡方式主要依赖于铁代谢和ROS代谢通路的调节，在细胞形态学、生化特征等方面与其他死亡方式都存在着显著差异。Stockwell组通过高通量筛选的方式找到了化学小分子RSL3可以诱导铁死亡，后续的实验表明只有（1S, 3R）构型有诱导铁死亡的活性，而（1R, 3R）构型的活性只有（1S, 3R）活性的1/200。基于这一现象，作者使用rdTOP-ABPP技术一次性定量比较了DMSO、(1S, 3R)-RSL3、(1R, 3R)-RSL3对蛋白质组中半胱氨酸的标记情况，并发现了一个被（1S,3R）构型RSL3特异性修饰的高置信度位点为VDAC2的47位半胱氨酸。

由于rdTOP-ABPP方法简单高效，并且与多种商业化可切割的生物素探针兼容，因此具有很好普适性和可推广性。这种新方法能够为发现和描述复杂生物系统中蛋白质配体的相互作用、药物靶标发现和蛋白质翻译后修饰等方面的研究提供新的技术选择。

这一成果近期发表在Analytical Chemistry上，文章的第一作者是北京大学的博士研究生杨帆和高晋君。北京大学罗陀平课题组的博士研究生车金腾、王初课题组的本科生贾国赓为该课题的完成提供了帮助。

该论文作者为：Fan Yang, Jinjun Gao, Jinteng Che, Guogeng Jia, Chu Wang

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

A Dimethyl-Labeling-Based Strategy for Site-Specifically Quantitative Chemical Proteomics

Anal. Chem., 2018, 90, 9576, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b02426

导师介绍

王初

http://www.x-mol.com/university/faculty/8705