Nature丨 邵峰组揭示病原细菌抑制宿主天然免疫防御的新机制

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BioArt按：北京时间10月12日凌晨，北京生命科学研究所邵峰实验室在Nature杂志在线发表题为“Ubiquitination and degradation of GBPs by a Shigella effector to suppress host defense”的研究论文，该研究报道了志贺氏痢疾杆菌的效应蛋白IpaH9.8通过泛素化并降解宿主细胞内的一类被干扰素调节的鸟苷酸结合蛋白，从而抑制宿主的免疫反应从而促进病原菌在宿主内的生存和增殖。为了使读者深入了解该项工作，BioArt特别邀请到了华中农业大学生物医学中心李姗教授作详细解读，以飨读者！

撰文丨李姗（华中农业大学生命科技学院／生物医学中心教授）

鸟苷酸结合蛋白GBP（Interferon-inducible guanylate-binding proteins）在天然免疫通路中被干扰素诱导表达，是近年来该科研领域的明星分子。GBP蛋白是一类非常保守且庞大的家族，在人的基因组中有7个同源基因，而在小鼠的基因组中多达11个【1,2】。之前该领域的研究发现多种胞内侵染型的细菌感染细胞时，GBP蛋白会像LC3蛋白一样，包裹到细菌周围。

研究人员为了研究上述现象的调控机制，制备了稳定表达GFP-hGBP1／mCherry-Gal3的多种细胞系，并对它们进行了单克隆化，在沙门氏菌、耶尔森菌、李斯特菌等多种肠道致病菌感染的时候，正如前人报道，hGBP1会包裹到细菌周围，而在志贺氏痢疾杆菌感染时，hGBP1蛋白却被发现神奇的消失了（下图）（作者首先建立了一个可以监测GBP1蛋白在细菌感染时动态变化的活细胞成像体系。据悉如果只是在过表达体系中，因为表达量不合适，并不是很容易观察到后续的蛋白降解现象，而作者将稳转细胞系单克隆化后，GBP蛋白的降解现象十分明显，这为后续的遗传筛选奠定了基础。用上述体系，筛选了一系列胞内侵染的肠道致病菌，意外发现有且只有痢疾杆菌感染时，会有GBP1降解的现象，而此现象则成为了整篇文章的基石。先有一个robust assay，再在这个体系上广泛尝试，发现最明显的现象，可见，此Nature课题并不是谁刻意design，而是在最优化的体系里，由有趣的现象initiate的），并且这种蛋白消失依赖于蛋白酶体活性。通过在志贺氏杆菌中全基因组转座子文库筛选发现，在13000个突变体中，只有ipaH9.8基因的突变（P103D9，下图左下）会导致hGBP1蛋白降解表型的消失。

IpaH9.8属于志贺氏杆菌三型分泌系统效应蛋白IpaH家族中的一员【3】。IpaH家族蛋白的C端都含有一个保守的具有泛素连接酶活性的结构域和一个相对有变化的N端富亮氨酸重复结构【4】。然而，大部分IpaH家族蛋白的生理底物尚未明确。细胞水平的细菌感染实验和蛋白重组表达的体外反应都表明，IpaH9.8可以直接催化hGBP1蛋白上K-48连接的多泛素链的形成，并进而通过蛋白酶体降解修饰后的蛋白。在细菌感染时，此修饰和降解过程发生在细胞质中。本文进一步研究发现，IpaH9.8可以作用于多个GBP家族成员，且不依赖于GBP的核苷酸结合状态和蛋白的功能性差别。而当IpaH9.8不存在或者识别GBP的氨基酸残基被突变时，一部分GBP家族的蛋白会正常定位到胞内志贺氏菌上来抑制其生长。

在小鼠感染模型中，IpaH9.8降解GBP蛋白对于细菌的复制和小鼠的存活都至关重要。当小鼠缺失一部分可以被IpaH9.8降解的GBP蛋白时，对于野生型志贺氏菌的感染，小鼠呈现出和野生型小鼠一样的表型，都会致死。但是对于ipaH9.8基因缺失的志贺氏菌感染实验组，野生型小鼠可以存活，而Gbpchr3-/-型小鼠却仍然致死。这些结果都强调了IpaH9.8降解GBP在细菌感染过程中的重要作用。

早在9年前，邵老师实验室就利用结构生物学的研究发现IpaH家族蛋白是泛素连接酶（NSMB，2008。一作是时任邵老师的博士后，现任职于浙江大学生命科学研究院的朱永群教授），再加上邵峰老师对各种酶学活性拥有“人工智能”般的理解（曾经通过一个精氨酸单点突变失活现象，猜出某蛋白是双指TBC-GAP【5】，Cell，2012.； 通过比较各种Caspase的精细结构，猜出Caspase11就是LPS的受体【6】，Nature，2014），所以对邵峰组来说，猜出IpaH家族参与降解GBP蛋白并非难事。但作者还是采用高通量高可信度的遗传筛选的手段，在一万多个细菌基因缺失突变体中，准确发现IpaH9.8在其中扮演核心作用，使得数据的可靠性和完美度又提升一个层级。

在发现IpaH9.8参与其中后，作者又检测了全部7个IpaH家族蛋白，有且只有IpaH9.8具备降解GBP蛋白的能力。同时，作者还将18个来源于人和小鼠的GBP蛋白，从细胞生物学看定位、细菌感染看降解、体外pull down看结合力三个层面，逐一进行研究，发现了不同GBP蛋白之间在响应细菌感染时的差异（笔者猜想，这又为后续源源不断的重量级发现埋下了种子）。读邵老师实验室的文章，总有一种酣畅淋漓、一锤定音的感觉，这与缜密的逻辑，巨大的工作量，高质量数据都是分不开的。

综上，该研究首次报道了在志贺氏痢疾杆菌感染下IpaH9.8的生理底物是GBP家族蛋白，通过降解GBP家族蛋白来抑制宿主对细菌的清除。该研究揭示了GBP蛋白在细菌感染时会聚集到细菌周围并导致细菌发生形变的重要功能，并建立了志贺氏杆菌免疫感染小鼠的模型，为进一步研究GBP家族的蛋白的生化机制提供了有效的工具。

值得关注的是，本文为本年度邵峰院士实验室发表的第二篇Nature论文。邵峰实验室的研究方向可以概括为“病原菌感染与宿主先天性免疫的分子机制”，今年5月发表在Nature杂志的论文报道了caspase-3可以通过切割和活化GSDME (DFNA5)蛋白诱导细胞焦亡并进一步发现该焦亡通路是部分化疗药物产生毒副作用的重要原因之一【7】（【BioArt专访邵峰院士】详解细胞焦亡新机制），属于“宿主免疫”方向；而本篇Nature论文报道了志贺氏痢疾杆菌的效应蛋白IpaH9.8通过泛素化并降解宿主细胞内的一类被干扰素调节的鸟苷酸结合蛋白（GBPs，Interferon-inducible guanylate-binding proteins），来抑制宿主的免疫反应从而促进病原菌在宿主内的生存和增殖，属于“病原菌感染机制”方向。半年内连续在Nature发表两大相关方向的重大科学发现和机理，充分彰显了邵峰院士及其研究组成员深厚的学术积淀、扎实的科研实力、敏锐的科学眼光以及创造性的工作能力。据悉，本文的第一作者李鹏已获得本年度的“吴瑞生命科学研究优秀奖”，颁奖活动将于10月14-15日在生物物理所举办。

后记：上月底在厦门召开的全国细胞生物学大会上，邵峰老师应邀做特邀报告，并获得中国细胞生物学学会颁发的“杰出成就奖”，以表彰其近五年来在细胞生物学领域内获得的重要研究成果和对我国细胞生物学发展做出的突出贡献。

图为邵峰院士在2017中国细胞生物学学会全国学术大会上做特邀报告。图片由周学迅先生友情提供。

作者简介：李姗，现任华中农业大学生命科技学院／生物医学中心教授，十堰市太和医院中心实验室主任。2007年本科毕业于中国农业大学，2007.09-2013.07中国农业大学／北京生命科学研究所联合培养，获生物化学与分子生物学博士学位；2013.08-2015.03在北京生命科学研究所邵峰实验室从事博士后研究。曾获2013年度“吴瑞生命科学研究优秀奖”。

参考文献：

1.Kim, B.-H. et al. Interferon-induced guanylate-binding proteins in inflammasome activation and host defense.Nat Immunol17, 481–489 (2016).

2.Meunier, E. & Broz, P. Interferon-inducible GTPases in cell autonomous and innate immunity.Cellular Microbiology18, 168–180 (2015).

3.Ashida, H., Toyotome, T., Nagai, T. & Sasakawa, C. Shigella chromosomal IpaH proteins are secreted via the type III secretion system and act as effectors.Mol Microbiol63, 1–14 (2007).

4.Zhu, Y. et al. Structure of a Shigella effector reveals a new class of ubiquitin ligases.Nat Struct Mol Biol15, 1302–1308 (2008).

5.Shao, N. D. Y. Z. Q. L. L. H. Y. Z. F. et al. Structurally Distinct Bacterial TBC-like GAPs Link Arf GTPase to Rab1 Inactivation to Counteract Host Defenses.Cell150, 1029–1041 (2012).

6.Shi, J. et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS.Nature1–18 (2014).

7.Wang, Y. et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin.Nature547, 99–103 (2017).