消灭顽固细菌生物被膜的利器之“越王青铜剑”：食盐促进的铜芬顿反应

生物被膜是指细菌粘附于接触表面，分泌的多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。如果把致病菌看作威胁健康的恐怖分子，即使个体战斗力强大，但破坏力有限，而且容易被消灭；但是当细菌集聚起来，形成生物被膜，好比恐怖分子拉帮结伙，利用分泌的大分子多糖、蛋白质、DNA，甚至同伴的尸体（统称为extracellular polymeric substances, EPS）修碉堡、挖战壕，建立“基地组织”会非常顽固、难以清除。作为细菌抵抗恶劣环境进化出的一种有效生存手段，生物被膜广泛存在于各种潮湿的表面上，例如食品、食品加工设备、自来水管道、工业管道、通风设备、医疗器械甚至病理状态下的人体组织器官表面等，给食品、医药器械卫生安全带来隐患；该聚集膜附着在海洋船体、工业管道或者通风设备管道，也给能源利用带来巨大的损失。

为了抑制或清除生物被膜，目前常用的方法十分“粗暴”，如高压喷射处理、空气撞击、辐射处理、超声波等物理方法，亚硝酸、过氧化氢、次氯酸等清洗剂和消毒剂清洗等化学方法。如今纳米材料提供了很多精致有效的新武器，比如类过氧化物酶的纳米模拟酶（peroxidase-like nanozyme），包括CuO、Fe₃O₄铁磁颗粒、TiO₂、CeO、ZnO、V₂O₅、氧化石墨烯等纳米材料。在这一领域，扬州大学医学院任职的高利增取得开创性成果。十年前他在中国科学院攻读博士学位期间发表Nature Nanotechnology 文章（Nat. Nanotech., 2007, 2, 577），后来又在美国宾夕法尼亚大学牙医学院从事模拟酶清除生物被膜的研究（Nanoscale, 2014, 6, 2588），后来在中国科学院长春应用化学研究所与上海分院的研究人员合作利用氧化石墨烯等制备的材料也很出色。在这些方法中，纳米材料表面产生的活性氧自由基被认为是杀菌或者降解生物膜的主要武器。最近也有研究指出CeO和V₂O₅的纳米“棒子”（Nanorods）可以模拟髓过氧化物酶，在海水中产生活性的次溴酸，进而溴化生物被膜形成必要的通信分子。当细菌之间不能有效联络通信，就不能协调行动建立基地形成生物被膜。而在海运船底防污漆里广泛添加的铜和亚铜离子如何抑制生物膜的生长，铜能否成为摧毁生物被膜的利器引起人们的思考。

最近，浙江工商大学食品与生物工程学院的王丽副教授团队与加拿大卡普顿大学的Xu Zhang研究员实验室合作发现，在铜芬顿化学体系中（Cu–H₂O₂），即使在双氧水（H₂O₂）低至mM的水平下，其中只要加入适量食盐（其中氯离子浓度与海水中相当），就能产生大量的活性氯，可以快速清除生物被膜（见示意图）。尽管以往的研究表明铜能够抗菌，活性氯可以通过细菌蛋白去折叠而发生聚集，从而实现有效灭菌（Cell, 2008, 135, 691），生活中作为活性氯载体的漂白粉也是一种环保而有效的杀菌剂，但这是首次报道氯离子能够极大地促进铜离子的抗菌及抗生物膜能力。

原理示意图

研究人员发现，相比于单独使用氧化铜、氯化钠、双氧水或者任意两两组合，CuO–H₂O₂–NaCl这一“青铜剑”组合不但能够有效降解组成EPS的生物大分子（壳聚糖凝胶、牛血清蛋白、鲱鱼精DNA等作为模型生物分子，见下图），还能够更加有效地抑制游离的大肠杆菌和金黄葡萄球菌的生长，而且能够杀灭被生物膜保护的铜绿假单胞菌。

CuO-H₂O₂-Cl^-抗菌和清除生物被膜的效果明显强于CuO-H₂O₂组及其他组的原因是，氧化铜在酸性介质中可以溶解，以Cu²⁺的形式存在，Cl^-加速Cu²⁺/Cu⁺的循环，从而加速铜芬顿反应的进行。研究人员通过实验证实活性氯的生成，以肉桂醇为模型分子，发现CuO-H₂O₂-Cl^-体系能使肉桂醇氯化，随着Cl^-浓度的增高，氯化产物增多，由此证明了活性氯的存在，该实验在Xu Zhang研究员团队早期发表的论文中亦有阐述（Chem. Commun., 2016, 52, 2087）。

不同组合的试剂对蛋白质（A）、DNA（B）、多糖（C）和生物膜（D）的降解能力

这项研究的成果发表在RSC旗下期刊Chemical Communications 上，第一作者是王丽副教授。该研究的意义在于不仅为围剿生物被膜的“基地组织”提供了另外一种高效价廉的利器“青铜古剑”，完全可以与“玄铁重剑”、“石墨烯阔剑”、“纳米银毒糊糊”以及“氧化铈纳米棒子”等大杀器一起荣登“生物被膜杀器排行榜”。该工作还揭示了几十年利用氧化铜、氧化亚铜作为海洋运输舰船底防污漆的作用机制，加深了人们对经典铜芬顿反应的认识。该发现在抗菌和抗生物膜方面具有广泛的应用前景，目前该成果已经申请专利保护。

该论文作者为：Li Wang, Yanni Miao, Mingsheng Lu, Zhi Shan, Shan Lu, Jiaojiao Hou, Qiumei Yang, Xinle Liang, Tao Zhou, Dennis Curry, Ken Oakes and Xu Zhang

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Chloride-accelerated Cu-Fenton chemistry for biofilm removal

Chem. Commun., 2017, 53, 5862-5865, DOI: 10.1039/C7CC00928C