生物正交“剪切反应”介导的蛋白质快速激活

生物正交反应是一类能在生命体内进行的化学反应。早期的生物正交反应主要是连接反应，用于将荧光染料等功能小分子以共价键的形式高效特异地连接到活体内的生物大分子上。

北京大学陈鹏课题组（点击查看介绍）近年来逐渐开始关注和发展生物正交“剪切反应”，利用氨基酸侧链上化学键的选择性断裂，实现活体内蛋白质的特异激活。此前，他们利用逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应（iDA）介导的断键反应，并结合非天然氨基酸定点插入技术在活细胞内成功激活了激酶蛋白。但是该反应的激活效率以及速率有待进一步提高，以用于活体内比较快速的生命过程的研究。为了进一步提高断键速率，近期他们对iDA反应进行了系统深入的研究，并在此基础上开发出了第二代四嗪分子，用于活细胞内蛋白质的快速激活。

为了准确快速地比较不同取代基对四嗪分子活性的影响，他们发展了一套基于香豆素的荧光筛选平台，可以通过检测反应的荧光强度来判断断键反应的进程。在系统地比较了一系列具有不同位阻以及不同电性的对称四嗪分子后，他们发现小位阻的烷基取代基在剪切反应中表现最好。由于该剪切反应是一个两步的反应：第一步是iDA加成反应生成加成中间体，该中间体自发的电子重排导致第二步的脱除反应。接下来的液质联用分析表明，吸电子基团（EWG）可促进第一步加成反应，但是会明显阻碍第二步的脱除反应。而相对电中性的烷基基团会减慢第一步加成反应，但是却有利于第二步的脱除。

基于以上结论，他们设计了一类非对称四嗪分子（第二代四嗪激活剂），一侧引入EWG基团用于加速第一步加成反应，另外一侧引入小的烷基基团用于促进第二步的脱除反应。接下来的实验结果证明这一类非对称的四嗪分子可以大幅度提高整体剪切反应的速率。

接下来他们利用非天然氨基酸定点插入技术将反式环辛烯保护的赖氨酸（TCOK）插入到模型蛋白GFP中，并用第二代四嗪激活剂处理蛋白。体外以及活细胞内的实验均表明第二代四嗪分子显著提高了剪切反应的速度。当TCOK插入萤火虫萤光素酶的活性位点时，该酶的活性被完全抑制。在活细胞中，第二代四嗪分子可在四分钟内高效激活该酶（>90%）。这类快速激活蛋白的方法将有望用于活体内快速生理过程的研究。

这一成果近期发表在《Angewandte Chemie International Edition》上，文章的第一作者是北大-清华生命科学联合中心的博士后樊新元。

该论文作者为：Xinyuan Fan, Yun Ge, Feng Lin, Yi Yang, Gong Zhang, William Shu Ching Ngai, Zhi Lin, Siqi Zheng, Jie Wang, Jingyi Zhao, Jie Li, Peng R. Chen*

http://onlinelibrary.wiley.com/wol1/doi/10.1002/anie.201608009/abstract

Optimized Tetrazine Derivatives for Rapid Bioorthogonal Decaging in Living Cells

Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 14046-14050, DOI: 10.1002/anie.201608009

导师介绍

陈鹏教授：http://www.x-mol.com/university/faculty/8704