新型嵌合二萜环化酶产物合成机理研究

萜类化合物是自然界中种类最为丰富的一类天然产物，这其中，真菌是萜类化合物的一个重要来源。近年来基因组学、分子生物学及天然产物化学技术的发展使得研究人员能够突破原有宿主的限制，在异源系统中对天然产物生物合成基因及其产物合成机理进行系统深入的研究。近两年来，刘天罡教授课题组已利用该课题组开发的基于代谢工程平台的天然产物研究策略从丝状真菌体内挖掘了FgFS、FgGS、FgMS等一系列催化合成具有新颖骨架的倍半萜（C15）、二萜（C20）以及二倍半萜（C25）的萜类合酶。Colletotrichum gloeosporioides是一株分离自湖北恩施药用植物蛇足石杉的内生真菌。地质学研究结果显示，在2.27亿年之前，恩施基本上是一片汪洋大海，2.27亿年之后经地壳升降运动变成陆地，在这一造陆过程中是否存在着从海洋生物与陆生生物之间的基因交流与交换是一个值得深思的话题。

二萜产物的骨架主要是由萜类环化酶（terpene cyclase，TC）以GGPP(C20)为底物催化而来。近年来，研究发现在真菌体内还存在着一类同时含有异戊烯基转移酶（prenyltransferase，PT）以及萜类环化酶（TC）结构域的嵌合的萜类合酶，能够以IPP和DMAPP(C5)，或者GPP(C10)、FPP(C15)、GGPP(C20)为直接底物，催化合成二萜以及二倍半萜产物。前人进行系统发育分析结果显示，这些萜类合酶可以分为5个主要类群(A-F)，根据产物合成第一步环化方式的不同可以分为Clade I (C1-IV-V)和Clade II (C1-III-IV)两大类群。Clade I为二倍半萜特有的环化方式，Clade II为二萜和二倍半萜共有的环化方式。迄今为止，研究人员已研究了除D进化分支之外其它分支的萜类合酶，而有关D分支萜类合酶生物合成情况迄今为止仍是一个未解之谜。

Dolastane类衍生物是一类以5/7/6环系三环二萜为核心骨架的二萜类化合物。迄今为止，研究人员已从褐藻等海洋藻类中分离获得二十多种dolastane类衍生物，其广泛的细胞毒活性、抗癫痫、抗超级细菌、抗炎症等生物活性吸引了大量研究人员的目光。然而这一类化合物的起源于合成机理长期悬而未决。

近日，《德国应用化学》杂志（Angewandte Chemie International Edition）在线发表了武汉大学药学院刘天罡教授课题组与德国波恩大学Jeroen S. Dickschat教授课题组关于嵌合萜类环化酶催化二萜合成的合作研究论文，填补了嵌合萜类环化酶分支上的空白。这项突破是该课题组提出的“基于代谢工程平台的萜类化合物挖掘新策略”思路以后的科学性和创造性实施，是高效利用人工设计的代谢工程高产平台实现药物新产物高效挖掘和改造的成功应用。这也是该课题组连续在Metabolic Engineering、Current Opinion in Biotechnology、Organic Letters 发表萜类产物挖掘新方法及产物合成机制以来，再次在该领域取得的最新突破。其主要特点包含以下几个方面：

1. 填补了Clade II-D萜类合酶及产物合成机理研究的空白。

2. CgDS的功能验证也填补了dolastane生物合成研究的空白。

3. 解析了CgDS催化产物1和2产物合成的机理，CgDS催化产物1的合成以罕见的两步催化方式完成，首先合成中性的中间体2，随后再进一步合成终产物1。

4. 为后续生物合成具有生物活性的dolastane类产物以及化学半合成其衍生物提供很大的便利。

Dolastane类衍生物是一类具有多种生物活性的二萜类化合物。Colletotrichum gloeosporioides 是一株分离自湖北恩施药用植物蛇足石杉的内生真菌。刘天罡教授课题组通过生物信息学分析从该菌基因组中挖掘了归属于D进化分支的嵌合萜类合酶CgDS。借助课题组前期通过代谢工程改造的酿酒酵母萜类高产平台的优势，挖掘并表征了两种先前已知萜类骨架的未知对映体(5R,12R,14S)-dolasta-1(15),8-diene (1)以及 (+)-(1R)-δ-araneosene (2)，并在原始真菌中进行嵌合萜类合酶CgDS的激活，双重确定这一功能。

合作者Jeroen S. Dickschat课题组通过体外饲喂同位素标记的对映选择性标记的底物[¹³C, ²H] -GGPP（六种不同的同位素异构体，(R)-, (S)-(1-¹³C, 1-²H)GGPP，(R)-, (S)-(1-¹³C, 1-²H)GPP以及未标记的IPP；(E)-, (Z)-(4-¹³C, 4-²H)IPP以及未标记的DMAPP为底物），结合HSQC分析确定化合物1的绝对构型为(5R,12R,14S)-dolasta-1(15),8-diene。随后，以特异性²H-和¹³C-标记的(14-²H)- 和(10-²H)GGPP以及(16-¹³C)- 和(17-¹³C)GGPP为底物，系统地阐明了CgDS催化合成化合物1和2的机理。CgDS采用典型的Clade II环化方式，首先GGPP脱去焦磷酸基团并经C1-III-IV环化生成具有5-11环系统的A，随后经1,2-H迁移生成B，紧接着B去质子化得到化合物2。GGPP的C-6的质子化得到C，并且最终去质子化得到化合物1。

武汉大学药学院博士后卞光凯、王璋倩，以及波恩大学博士生Jan Rinkel为共同第一作者，刘天罡教授和德国波恩大学Jeroen S. Dickschat教授为共同通讯作者。该课题得到万人计划青年拔尖人才项目、国家自然科学基金、博士后科学基金面上项目和重点项目的经费支持。

该论文作者为：Guangkai Bian, Jan Rinkel, Zhangqian Wang, Lukas Lauterbach, Anwei Hou, Yujie Yuan, Zixin Deng, Tiangang Liu, Jeroen S. Dickschat

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

A Clade II‐D Fungal Chimeric Diterpene Synthase from Colletotrichum gloeosporioides Produces Dolasta‐1(15),8‐diene

Angew. Chem. Int. Ed., 2018, DOI: 10.1002/anie.201809954

通讯作者简介

刘天罡教授现任武汉大学药学院教授，国家优秀青年基金获得者，中组部青年拔尖人才。自2010年从斯坦福大学归国加盟武汉大学药学以来，提出并完善了“定向合成代谢”（Targeted Synthetic Metabolism）技术体系，利用该技术体系解决微生物药物、重要天然产物高效合成，以及拓展到天然产物的批量挖掘，并与众多企业合作利用该技术平台指导实际工业生产。刘天罡教授作为通讯作者在PNAS、Angewandte Chemie International Edition、Current Opinion in Biotechnology、Metabolic Engineering、Biotechnology for Biofuels、ACS Synthetic Biology、Organic Letters 等期刊发表论文四十余篇，多次受邀在国际学术会议上进行大会特邀报告，担任Metabolic Engineering Communications副主编，Metabolic Engineering, ACS Synthetic Biology, Biotechnology Journal, Synthetic and Systems Biotechnology 等杂志编委。

http://www.x-mol.com/university/faculty/50001