整合基因组和转录组测序揭示枯草芽孢杆菌合成核黄素的遗传基础

通过传统的物理化学诱变进行微生物育种，可以获得优良性状（表型）菌株，用于微生物发酵工业。但由于突变的随机性和不确定性，通过诱变方法获得的优良菌株通常具有遗传背景不清晰等缺点。且积累的突变，大多数突变为中性或负向突变，仅有极少部分和优良性状正相关。面对大量突变，如何筛选和鉴定正向突变，阐明优良性状的遗传基础是当前研究的难点之一。近年来，高通量测序技术及系统生物学研究法的快速发展，为解析优良表型菌株的遗传调控机理提供了有力工具。

近日，天津大学化工学院代谢工程与系统生物学团队，综合利用基因组和转录组测序分析、代谢组学等系统生物学研究方法，系统分析了核黄素生产突变菌株B. Subtilis 24/pMX45过量积累核黄素的遗传调控机理，进一步结合逆向代谢工程和理性代谢工程手段构建了高产核黄素工程菌株。

作者分别通过Roche 454 GS FLX Titanium 和Illumina HiSeq 2000对突变菌株B. subtilis 24/pMX45进行了全基因组和转录组测序，发现该菌株经过诱变后积累高达500多个突变，超过900个基因转录水平上调或下调。整合基因组和转录组测序数据分析，从500多个突变中挑选出28个潜在重要突变，通过迭代循环的方法将突变引入到野生型枯草芽孢杆菌中，验证突变的效应。结果发现7个正向突变和核黄素过量积累相关，包括RibC (G199D)、ribD⁺(G+39A)、PurA (P242L)、CcpN(A44S)、YvrH (R222Q)、YhcF (R90*)、YwaA (Q68*)。

作者对发现的每个正向突变导致核黄素高产的遗传机制进行了细致分析。在这些正向突变中，首次发现与核黄素积累相关的突变包括YvrH (R222Q)、YhcF (R90*)和YwaA (Q68*)，其中YvrH (R222Q)突变导致了细胞自溶酶LytC的过表达。LytC的过表达导致细胞壁部分裂解，影响了细胞的通透性，部分解调控嘌呤合成途径，增加了核黄素合成前体物GTP的供给，最终导致核黄素合成能力的提高。作者进一步将该优良性状分子机制应用于谷氨酸棒状杆菌合成5-氨基乙酰丙酸，其产量提高了20%以上，说明通过扰动细胞通透性提高代谢物产量的策略具有一定的通用性。

图1. 理性代谢工程修饰策略

最后，作者以迭代重构获得的包含所有正向突变工程菌株为基础，通过解调控嘌呤途径、定向进化关键酶、过表达核黄素操纵子、扰动呼吸链和切断溢流代谢等多种代谢工程策略，最终构建出核黄素高产菌株BS125，其核黄素产量是诱变菌株B. subtilis 24/pMX45的3.4倍（摇瓶发酵达到4.23±0.34 g/L），且工程菌株遗传稳定，遗传背景清晰，便于进一步代谢工程改造。

图2. 菌株重构过程

该研究利用基因组学、转录组学、代谢物组学等系统生物学手段系统分析产核黄素枯草芽孢杆菌的遗传基础，对阐明枯草芽孢杆菌产核黄素的遗传调控机制具有重要意义。此外，新发现的突变对于枯草芽孢杆菌生产其他生物基产品具有重要应用价值。

相关研究成果近期发表在代谢工程领域TOP期刊Metabolic Engineering上，文章的通讯作者为天津大学化工学院生物化工系王智文副教授，第一作者为天津大学化工学院生物化工系博士王光路、石婷和陈涛教授。王光路博士现为郑州轻工业学院食品与生物工程学院讲师，石婷现为中国科学院天津工业生物技术研究所助理研究员。

该论文作者为：GuangluWang, Ting Shi, Tao Chen, Xiaoyue Wang, Yongcheng Wang, Dingyu Liu, Jiaxin Guo, Jing Fu, Lili Feng, Zhiwen Wang, Xueming Zhao

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Integrated whole-genome and transcriptome sequence analysis reveals the genetic characteristics of a riboflavin-overproducing Bacillus subtilis

Metab. Eng., 2018, 48:138-149, DOI: 10.1016/j.ymben.2018.05.022

作者简介

王智文，博士，天津大学化工学院生物化工系副教授，博士生导师。2011年于天津大学化工学院制药工程系获得博士学位，同年受聘为天津大学化工学院生物化工系讲师。系统生物工程教育部重点实验室、天津化学化工协同创新中心和发酵技术国家工程研究中心成员。美国化学工程师协会（AIChE）和国际代谢工程学会（IMES）会员。2014年入选“天津大学北洋学者-青年骨干教师”。主持国家“863”计划子课题，国家自然科学基金青年基金、面上项目等国家级项目5项、省部级项目1项，以学术骨干参与国家级项目5项。第一/通讯作者在Green Chemistry、Metabolic Engineering、ACS Synthetic Biology、Biotechnology for Biofuels、Biotechnology& Bioengineering 等高水平期刊发表SCI收录论文28篇；第一发明人申请国家发明专利12项；以副主编参编国家级规划教材《代谢工程》，执笔4万余字。王智文副教授的研究方向包括：基因组尺度代谢网络模型重构与模拟设计；基因组编辑与合成生物学元件开发；合成重要生物基化学品、能源、医药的微生物细胞工厂构建。

王光路，博士，郑州轻工业学院食品与生物工程学院讲师。2014年博士毕业于天津大学化工学院生物化工专业，师从赵学明教授。2015年任教于郑州轻工业学院食品与生物工程学院，讲师。第一作者发表5篇SCI论文，授权专利3项，主持和参与多项国家自然科学基金项目。研究方向：代谢工程、系统生物学和合成生物学。邮箱：wangguanglu@zzuli.edu.cn。

石婷，博士，中国科学院天津工业生物技术研究所助理研究员。2014年博士毕业于天津大学化工学院生物化工专业，师从赵学明教授。2015年任职于中国科学院天津工业生物技术研究所，助理研究员。第一作者发表SCI收录论文4篇，授权专利3项。主持国家自然基金青年基金1项，参与多项国家级项目和横向课题。研究方向：体外合成生物学，致力于体外多酶催化技术的研究和工业化应用。邮箱：shi_ting@tib.cas.cn。

陈涛，博士，天津大学化工学院生物化工系教授，博士生导师。简介详见链接http://chemeng.tju.edu.cn/cn/szdw?type=detail&id=64  。