乙醇升级为长链醇人工生物合成途径的开发

众所周知，乙醇可通过生物质发酵制备，是一种潜在的可再生能源和清洁燃料。然而乙醇作为燃料还存在不少缺陷：能量密度比汽油低、吸水性强、运输成本高、蒸气压高等。而长链醇（如丁醇）与汽油更相似，可以克服乙醇以上诸多的缺陷，成为近年来生物能源领域的研究热点。

最近，福建农林大学的张燎原副教授（点击查看介绍）课题组采用无细胞代谢工程技术结合蛋白质工程的方法，设计了一条新的乙醇升级C4化合物（3-羟基丁酮、2,3-丁二醇、丁酮和2-丁醇）的人工合成途径，为短链醇升级为长链醇提供了一种高效、环境友好的合成方法，相关研究成果发表在Green Chemistry 上。

如图1A，作者首先构建了一条从乙醇合成3-羟基丁酮的途径：乙醇在乙醇脱氢酶（EtDH）、NADH氧化酶（NOX）及乙醛裂合酶（FLS）的级联催化下生成3-羟基丁酮；如图1B，3-羟基丁酮进一步在2,3-丁二醇脱氢酶（BDH）的催化下生成2,3-丁二醇。值得注意的是，为了避免还原性NADH的积累，作者对严格依赖于辅酶NAD⁺的EtDH进行了改造，使突变体EtDH:D46G可同时依赖NAD⁺和NADP⁺，实现了辅酶的供给平衡。如图1C，内消旋构型的2,3-丁二醇在二醇脱水酶（DDH）的作用下生成2-丁酮，最终2-丁酮在BDH的催化下生成2-丁醇，至此完成了乙醇至C4化合物的升级。

图1. 乙醇升级为C4化合物（3-羟基丁酮(A)、2,3-丁二醇(B)、丁酮和2-丁醇(C)）人工途径的设计

在此基础上，作者对影响该反应的条件进行了优化。如图2A，为了提高限速酶乙醛裂合酶（FLS）的催化效率，他们对位于底物通道和（或）结合口袋上的6个突变热点依次进行定点饱和突变。最终作者在482位点的Leu确定了若干有益突变，其中突变体L482S的kcat/Km 值比初始提高了72.95%。

图2. 乙醛裂合酶（FLS）的改造

如图3，在最佳催化条件下，作者以100 mM的乙醇作为底物，3-羟基丁酮、2,3-丁二醇及2-丁醇的产率分别达到了88.78%、88.28%和27.25%，说明该人工途径可作为一种潜在的高效、环境友好的合成方法。

图3. 乙醇生物合成3-羟基丁酮、2,3-丁二醇、2-丁醇的时间曲线图

最后，作者将酶固定在经戊二醛修饰的SiO₂纳米颗粒上，克服了酶活力不稳定、纯化成本高、产物难分离的问题。如图4，即使酶重复使用10次后产生的3-羟基丁酮仍然维持在初始的94%左右，2,3-丁二醇同样也维持在可观的73%左右，并未出现显著的降低。

图4. 固定化酶的再循环能力研究

该论文的共同第一作者分别是福建农林大学的张燎原副教授和韩国建国大学的Raushan Singh。张燎原副教授、建国大学的Jung-Kul Lee和韩国大学的Yun Chan Kan教授为共同通讯作者。该研究获得国家自然科学基金（81673542）、福建省新世纪优秀人才（K8015056A）、福建农林大学杰出青年项目（xjq201408）的联合资助。

该论文作者为：Liaoyuan Zhang, Raushan Singh, Sivakumar D, Zewang Guo, Jiahuan Li, Fanbing Chen, Yuanzhi He, Xiong Guan, Yun Chan Kang and Jung-Kul Lee

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

An artificial synthetic pathway for acetoin, 2,3-butanediol, and 2-butanol production from ethanol using cell free multi-enzyme catalysis

Green Chem., 2018, 20, 230, DOI: 10.1039/C7GC02898A

导师介绍

张燎原

http://www.x-mol.com/university/faculty/49519