We report the development of a fast and accurate fluorescence-based assay for amidine linked to cellulose membranes and Sepharose gel. The assay is founded on the glyoxal reaction, which involves reaction of an amidine group with glyoxal and an aromatic aldehyde, leading to the formation of a fluorophore that can be analyzed and quantified by fluorescence spectroscopy and imaging. While the assay has been reported previously for aromatic amidine estimation in solution phase, here we describe its adaptation and application to amidine linked to diverse forms of solid matrices, particularly benzamidine Sepharose and benzamidine-linked cellulose membranes. These functionalized porous matrices find important application in purification of serine proteases. The efficacy of a protein separation device is determined by, among other factors, the ligand (amidine) density. Hence, a sensitive and reproducible method for amidine quantitation in solid phase is needed. The glyoxal reaction was carried out on microbead-sized Sepharose gel and cellulose membranes. Calibration curves were developed for each phase, which established linearity in the range of 0-0.45 μmol per mL amidine for free amidine in solution, 0-0.45 μmol amidine per mL Sepharose gel, and 0-0.48 μmol per mL cellulose membrane. The assay showed high accuracy (~ 3.4% error), precision (RSD < 2%), and reproducibility. Finally, we show how this fluorescent labeling (glyoxal) method can provide a tool for imaging membranes and ligand distribution through confocal laser scanning microscopy. Graphical abstract.

中文翻译：

---

固相中不同配体密度的芳香am的原位分析和成像。

我们报告了一种快速，准确的基于荧光的am连接到纤维素膜和琼脂糖凝胶的测定方法的发展。该测定法基于乙二醛反应，后者涉及group基与乙二醛和芳族醛的反应，导致形成荧光团，可以通过荧光光谱和成像进行分析和定量。虽然先前已经报道了该测定法用于溶液相中芳族estimation估计的报道，但在此我们描述其对与多种形式的固体基质（尤其是联苯甲Sep琼脂糖和联苯idine连接的纤维素膜）连接的am的适应性和应用。这些功能化的多孔基质在丝氨酸蛋白酶的纯化中发现了重要的应用。蛋白质分离装置的功效除其他因素外，还取决于：配体（am）密度。因此，需要一种灵敏且可重现的固相中quant定量方法。乙二醛反应在微珠大小的琼脂糖凝胶和纤维素膜上进行。针对每个阶段制定了校准曲线，其线性范围为溶液中的游离idine为0-0.45μmol/ mL am，每mL Sepharose凝胶为0-0.45μmolidine和/ mL纤维素膜为0-0.48μmol。该测定法显示出很高的准确性（〜3.4％误差），精确度（RSD <2％）和可重复性。最后，我们展示了这种荧光标记（乙二醛）方法如何为通过共聚焦激光扫描显微镜对膜和配体分布成像提供工具。图形概要。乙二醛反应在微珠大小的琼脂糖凝胶和纤维素膜上进行。针对每个阶段制定了校准曲线，其线性范围为溶液中的游离idine为0-0.45μmol/ mL am，每mL Sepharose凝胶为0-0.45μmolidine和/ mL纤维素膜为0-0.48μmol。该测定法显示出高精度（〜3.4％误差），精度（RSD <2％）和可重复性。最后，我们展示了这种荧光标记（乙二醛）方法如何为通过共聚焦激光扫描显微镜对膜和配体分布成像提供工具。图形概要。乙二醛反应在微珠大小的琼脂糖凝胶和纤维素膜上进行。针对每个阶段制定了校准曲线，其线性范围为溶液中的游离idine为0-0.45μmol/ mL am，每mL Sepharose凝胶为0-0.45μmolidine和/ mL纤维素膜为0-0.48μmol。该测定法显示出很高的准确性（〜3.4％误差），精确度（RSD <2％）和可重复性。最后，我们展示了这种荧光标记（乙二醛）方法如何为通过共聚焦激光扫描显微镜对膜和配体分布成像提供工具。图形概要。每毫升Sepharose凝胶含45μmolidine，每毫升纤维素膜含0-0.48μmol。该测定法显示出很高的准确性（〜3.4％误差），精确度（RSD <2％）和可重复性。最后，我们展示了这种荧光标记（乙二醛）方法如何为通过共聚焦激光扫描显微镜对膜和配体分布成像提供工具。图形概要。每毫升Sepharose凝胶含45μmolidine，每毫升纤维素膜含0-0.48μmol。该测定法显示出很高的准确性（〜3.4％误差），精确度（RSD <2％）和可重复性。最后，我们展示了这种荧光标记（乙二醛）方法如何为通过共聚焦激光扫描显微镜对膜和配体分布成像提供工具。图形概要。