The use of RNA-seq as a generalized tool to measure the differential expression of genes has essentially replaced the use of the microarray. Despite the acknowledged technical advantages to this approach, RNA-seq library preparation remains mostly conducted by core facilities rather than in the laboratory due to the infrastructure, expertise and time required per sample. We have recently described two 'click-chemistry' based library construction methods termed ClickSeq and Poly(A)-ClickSeq (PAC-seq) as alternatives to conventional RNA-seq that are both cost effective and rely on straightforward reagents readily available to most labs. ClickSeq is random-primed and can sequence any (unfragmented) RNA template, while PAC-seq is targeted to poly(A) tails of mRNAs. Here, we further develop PAC-seq as a platform that allows for simultaneous mapping of poly(A) sites and the measurement of differential expression of genes. We provide a detailed protocol, descriptions of appropriate computational pipelines, and a proof-of-principle dataset to illustrate the technique. PAC-seq offers a unique advantage over other 3' end mapping protocols in that it does not require additional purification, selection, or fragmentation steps allowing sample preparation directly from crude total cellular RNA. We have shown that PAC-seq is able to accurately and sensitively count transcripts for differential gene expression analysis, as well as identify alternative poly(A) sites and determine the precise nucleotides of the poly(A) tail boundaries.

中文翻译：

---

开发 Poly(A)-ClickSeq 作为同时进行全基因组 Poly(A) 位点识别和差异表达分析的工具

使用 RNA-seq 作为测量基因差异表达的通用工具已经基本上取代了微阵列的使用。尽管这种方法具有公认的技术优势，但由于每个样本所需的基础设施、专业知识和时间，RNA-seq 文库制备仍然主要由核心设施而不是在实验室中进行。我们最近描述了两种基于“点击化学”的文库构建方法，称为 ClickSeq 和 Poly(A)-ClickSeq (PAC-seq) 作为传统 RNA-seq 的替代品，它们既具有成本效益，又依赖于大多数实验室容易获得的直接试剂. ClickSeq 是随机引物，可以对任何（未片段化的）RNA 模板进行测序，而 PAC-seq 则针对 mRNA 的 poly(A) 尾部。这里，我们进一步开发了 PAC-seq 作为一个平台，允许同时绘制 poly(A) 位点和测量基因的差异表达。我们提供了详细的协议、适当的计算管道的描述，以及用于说明该技术的原理验证数据集。PAC-seq 与其他 3' 末端映射协议相比具有独特的优势，因为它不需要额外的纯化、选择或片段化步骤，允许直接从粗制总细胞 RNA 中制备样品。我们已经证明 PAC-seq 能够准确而灵敏地计数用于差异基因表达分析的转录本，以及识别替代 poly(A) 位点并确定 poly(A) 尾部边界的精确核苷酸。我们提供了详细的协议、适当的计算管道的描述，以及用于说明该技术的原理验证数据集。PAC-seq 与其他 3' 末端映射协议相比具有独特的优势，因为它不需要额外的纯化、选择或片段化步骤，允许直接从粗制总细胞 RNA 中制备样品。我们已经证明 PAC-seq 能够准确而灵敏地计数用于差异基因表达分析的转录本，以及识别替代 poly(A) 位点并确定 poly(A) 尾部边界的精确核苷酸。我们提供了详细的协议、适当的计算管道的描述，以及用于说明该技术的原理验证数据集。PAC-seq 与其他 3' 末端映射协议相比具有独特的优势，因为它不需要额外的纯化、选择或片段化步骤，允许直接从粗制总细胞 RNA 中制备样品。我们已经证明 PAC-seq 能够准确而灵敏地计数用于差异基因表达分析的转录本，以及识别替代 poly(A) 位点并确定 poly(A) 尾部边界的精确核苷酸。最终定位方案，因为它不需要额外的纯化、选择或片段化步骤，允许直接从粗制总细胞 RNA 中制备样品。我们已经证明 PAC-seq 能够准确而灵敏地计数用于差异基因表达分析的转录本，以及识别替代 poly(A) 位点并确定 poly(A) 尾部边界的精确核苷酸。最终定位方案，因为它不需要额外的纯化、选择或片段化步骤，允许直接从粗制总细胞 RNA 中制备样品。我们已经证明 PAC-seq 能够准确而灵敏地计数用于差异基因表达分析的转录本，以及识别替代 poly(A) 位点并确定 poly(A) 尾部边界的精确核苷酸。