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Thermal shift assay: Strengths and weaknesses of the method to investigate the ligand-induced thermostabilization of soluble guanylyl cyclase.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis ( IF 3.1 ) Pub Date : 2019-12-23 , DOI: 10.1016/j.jpba.2019.113065 Christin Elgert 1 , Anne Rühle 1 , Peter Sandner 2 , Sönke Behrends 1
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis ( IF 3.1 ) Pub Date : 2019-12-23 , DOI: 10.1016/j.jpba.2019.113065 Christin Elgert 1 , Anne Rühle 1 , Peter Sandner 2 , Sönke Behrends 1
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Thermal shift assay is a fluorescence dye based biochemical method to determine the melting point of a protein. It can be used to investigate the ligand-induced stabilization of proteins and helps to increase the likelihood of crystallization in biological samples. Dimeric proteins like soluble guanylyl cyclase (sGC) have specific structural and functional properties which may pose a challenge in thermal shift measurements. In this paper, thermal shift assay was used to examine ligand-induced thermostabilization of the dimeric heme-containing protein soluble guanylyl cyclase. Adjustment of the parameters buffer solution, pH, protein / dye ratio and protein amount per well yielded a one-phase melting curve of sGC with a sharp transition and high reproducibility. We found that thermal shift measurement is not affected by heme state or heme content of the enzyme preparation. We used the method to investigate the thermostabilization of sGC induced by the heme-mimetic activator drugs cinaciguat, BAY 60-2770 and BR 11257 in combination with non-hydrolyzable nucleotides. Measurements with the dicarboxylic drugs cinaciguat and BAY 60-2770 yielded steep melting curves with high amplitudes. In contrast, in the presence of the monocarboxylic sGC activator BR 11257, melting curves appear flattened in the dye-based measurements. In the present paper, we show that activity-based thermostability measurements are superior to dye-based measurements in detecting the thermostabilizing influence of sGC activator drugs.
中文翻译：
热位移分析：研究配体诱导的可溶性鸟苷酸环化酶热稳定的方法的优缺点。
热移分析是一种基于荧光染料的生化方法，用于确定蛋白质的熔点。它可用于研究配体诱导的蛋白质稳定性，并有助于增加生物样品中结晶的可能性。像可溶性鸟苷酰环化酶（sGC）这样的二聚体蛋白具有特定的结构和功能特性，可能会对热位移测量造成挑战。在本文中，热位移分析用于检查配体诱导的含二聚体血红素的蛋白质可溶性鸟苷酸环化酶的热稳定作用。调节缓冲液，pH，蛋白质/染料比率和每孔蛋白质量等参数可生成具有明显转变和高重现性的sGC的单相熔解曲线。我们发现热位移测量不受酶制剂的血红素状态或血红素含量的影响。我们使用该方法来研究由血红素激活剂西那西瓜，BAY 60-2770和BR 11257结合不可水解核苷酸诱导的sGC的热稳定性。用二羧酸药物西那西瓜和BAY 60-2770进行的测量得出了陡峭的熔融曲线，具有高幅度。相反，在单羧酸sGC活化剂BR 11257的存在下，熔融曲线在基于染料的测量中显得平坦。在本文中，我们显示了在检测sGC活化剂药物的热稳定影响方面，基于活性的热稳定性测量优于基于染料的测量。我们使用该方法来研究由血红素激活剂西那西瓜，BAY 60-2770和BR 11257结合不可水解核苷酸诱导的sGC的热稳定性。用二羧酸药物西那西瓜和BAY 60-2770进行的测量得出了陡峭的熔融曲线，具有高幅度。相反，在单羧酸sGC活化剂BR 11257的存在下，熔融曲线在基于染料的测量中显得平坦。在本文中，我们显示了在检测sGC活化剂药物的热稳定影响方面，基于活性的热稳定性测量优于基于染料的测量。我们使用该方法来研究由血红素激活剂西那西瓜，BAY 60-2770和BR 11257结合不可水解核苷酸诱导的sGC的热稳定性。用二羧酸药物西那西瓜和BAY 60-2770进行的测量得出了陡峭的熔融曲线，具有高幅度。相反，在单羧酸sGC活化剂BR 11257的存在下，熔融曲线在基于染料的测量中显得平坦。在本文中，我们显示了在检测sGC活化剂药物的热稳定影响方面，基于活性的热稳定性测量优于基于染料的测量。用二羧酸药物西那西瓜和BAY 60-2770进行的测量得出了陡峭的熔融曲线，具有高幅度。相反，在单羧酸sGC活化剂BR 11257的存在下，熔融曲线在基于染料的测量中显得平坦。在本文中，我们显示了在检测sGC活化剂药物的热稳定影响方面，基于活性的热稳定性测量优于基于染料的测量。用二羧酸药物西那西瓜和BAY 60-2770进行的测量得出了陡峭的熔融曲线，具有高幅度。相反，在单羧酸sGC活化剂BR 11257的存在下，熔融曲线在基于染料的测量中显得平坦。在本文中，我们显示了在检测sGC活化剂药物的热稳定影响方面，基于活性的热稳定性测量优于基于染料的测量。
更新日期：2019-12-23
中文翻译：
热位移分析：研究配体诱导的可溶性鸟苷酸环化酶热稳定的方法的优缺点。
热移分析是一种基于荧光染料的生化方法，用于确定蛋白质的熔点。它可用于研究配体诱导的蛋白质稳定性，并有助于增加生物样品中结晶的可能性。像可溶性鸟苷酰环化酶（sGC）这样的二聚体蛋白具有特定的结构和功能特性，可能会对热位移测量造成挑战。在本文中，热位移分析用于检查配体诱导的含二聚体血红素的蛋白质可溶性鸟苷酸环化酶的热稳定作用。调节缓冲液，pH，蛋白质/染料比率和每孔蛋白质量等参数可生成具有明显转变和高重现性的sGC的单相熔解曲线。我们发现热位移测量不受酶制剂的血红素状态或血红素含量的影响。我们使用该方法来研究由血红素激活剂西那西瓜，BAY 60-2770和BR 11257结合不可水解核苷酸诱导的sGC的热稳定性。用二羧酸药物西那西瓜和BAY 60-2770进行的测量得出了陡峭的熔融曲线，具有高幅度。相反，在单羧酸sGC活化剂BR 11257的存在下，熔融曲线在基于染料的测量中显得平坦。在本文中，我们显示了在检测sGC活化剂药物的热稳定影响方面，基于活性的热稳定性测量优于基于染料的测量。我们使用该方法来研究由血红素激活剂西那西瓜，BAY 60-2770和BR 11257结合不可水解核苷酸诱导的sGC的热稳定性。用二羧酸药物西那西瓜和BAY 60-2770进行的测量得出了陡峭的熔融曲线，具有高幅度。相反，在单羧酸sGC活化剂BR 11257的存在下，熔融曲线在基于染料的测量中显得平坦。在本文中，我们显示了在检测sGC活化剂药物的热稳定影响方面，基于活性的热稳定性测量优于基于染料的测量。我们使用该方法来研究由血红素激活剂西那西瓜，BAY 60-2770和BR 11257结合不可水解核苷酸诱导的sGC的热稳定性。用二羧酸药物西那西瓜和BAY 60-2770进行的测量得出了陡峭的熔融曲线，具有高幅度。相反，在单羧酸sGC活化剂BR 11257的存在下，熔融曲线在基于染料的测量中显得平坦。在本文中，我们显示了在检测sGC活化剂药物的热稳定影响方面，基于活性的热稳定性测量优于基于染料的测量。用二羧酸药物西那西瓜和BAY 60-2770进行的测量得出了陡峭的熔融曲线，具有高幅度。相反，在单羧酸sGC活化剂BR 11257的存在下，熔融曲线在基于染料的测量中显得平坦。在本文中，我们显示了在检测sGC活化剂药物的热稳定影响方面，基于活性的热稳定性测量优于基于染料的测量。用二羧酸药物西那西瓜和BAY 60-2770进行的测量得出了陡峭的熔融曲线，具有高幅度。相反，在单羧酸sGC活化剂BR 11257的存在下，熔融曲线在基于染料的测量中显得平坦。在本文中，我们显示了在检测sGC活化剂药物的热稳定影响方面，基于活性的热稳定性测量优于基于染料的测量。
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