Delicate and transitory protein engagement at the plasma membrane (PM) is crucial to a broad range of cellular functions, including cell motility, signal transduction, and virus replication. Here, we describe a dual-color (DC) extension of the fluorescence z-scan technique, which has proven successful for quantification of peripheral membrane protein binding to the PM in living cells. We demonstrate that the coexpression of a second, distinctly colored fluorescent protein provides a soluble reference species that delineates the extent of the cell cytoplasm and lowers the detection threshold of z-scan PM-binding measurements by an order of magnitude. DC z-scan generates an intensity profile for each detection channel that contains information on the axial distribution of the peripheral membrane and reference protein. Fit models for DC z-scan are developed and verified using simple model systems. Next, we apply the quantitative DC z-scan technique to investigate the binding of two peripheral membrane protein systems for which previous z-scan studies failed to detect binding: human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) matrix (MA) protein and lipidation-deficient mutants of the fibroblast growth factor receptor substrate 2α. Our findings show that these mutations severely disrupt PM association of fibroblast growth factor receptor substrate 2α but do not eliminate it. We further detected binding of HIV-1 MA to the PM using DC z-scan. Interestingly, our data indicate that HIV-1 MA binds cooperatively to the PM with a dissociation coefficient of Kd ∼16 μM and Hill coefficient of n ∼2.

中文翻译：

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使用双色 Z 扫描荧光对与质膜结合的蛋白质进行灵敏检测

质膜 (PM) 上微妙而短暂的蛋白质参与对广泛的细胞功能至关重要，包括细胞运动、信号转导和病毒复制。在这里，我们描述了荧光 z 扫描技术的双色 (DC) 扩展，该技术已证明可成功量化与活细胞中 PM 结合的外周膜蛋白。我们证明了第二种颜色明显的荧光蛋白的共表达提供了一种可溶性参考物质，它描绘了细胞质的范围，并将 z 扫描 PM 结合测量的检测阈值降低了一个数量级。DC z-scan 为每个检测通道生成强度分布图，其中包含有关外周膜和参考蛋白轴向分布的信息。DC z 扫描的拟合模型是使用简单的模型系统开发和验证的。接下来，我们应用定量 DC z 扫描技术来研究两种外周膜蛋白系统的结合，之前的 z 扫描研究未能检测到这些系统的结合：人类免疫缺陷病毒 1 型 (HIV-1) 基质 (MA) 蛋白和脂化- 成纤维细胞生长因子受体底物 2α 的缺陷突变体。我们的研究结果表明，这些突变严重破坏了成纤维细胞生长因子受体底物 2α 的 PM 关联，​​但并没有消除它。我们使用 DC z 扫描进一步检测了 HIV-1 MA 与 PM 的结合。有趣的是，我们的数据表明 HIV-1 MA 与 PM 协同结合，解离系数为 Kd ~16 μM，希尔系数为 n ~2。我们应用定量 DC z 扫描技术来研究先前 z 扫描研究未能检测到结合的两种外周膜蛋白系统的结合：人类免疫缺陷病毒 1 型 (HIV-1) 基质 (MA) 蛋白和脂化缺陷成纤维细胞生长因子受体底物 2α 的突变体。我们的研究结果表明，这些突变严重破坏了成纤维细胞生长因子受体底物 2α 的 PM 关联，​​但并没有消除它。我们使用 DC z 扫描进一步检测了 HIV-1 MA 与 PM 的结合。有趣的是，我们的数据表明 HIV-1 MA 与 PM 协同结合，解离系数为 Kd ~16 μM，希尔系数为 n ~2。我们应用定量 DC z 扫描技术来研究先前 z 扫描研究未能检测到结合的两种外周膜蛋白系统的结合：人类免疫缺陷病毒 1 型 (HIV-1) 基质 (MA) 蛋白和脂化缺陷成纤维细胞生长因子受体底物 2α 的突变体。我们的研究结果表明，这些突变严重破坏了成纤维细胞生长因子受体底物 2α 的 PM 关联，​​但并没有消除它。我们使用 DC z 扫描进一步检测了 HIV-1 MA 与 PM 的结合。有趣的是，我们的数据表明 HIV-1 MA 与 PM 协同结合，解离系数为 Kd ~16 μM，希尔系数为 n ~2。人类免疫缺陷病毒 1 型 (HIV-1) 基质 (MA) 蛋白和成纤维细胞生长因子受体底物 2α 的脂化缺陷突变体。我们的研究结果表明，这些突变严重破坏了成纤维细胞生长因子受体底物 2α 的 PM 关联，​​但并没有消除它。我们使用 DC z 扫描进一步检测了 HIV-1 MA 与 PM 的结合。有趣的是，我们的数据表明 HIV-1 MA 与 PM 协同结合，解离系数为 Kd ~16 μM，希尔系数为 n ~2。人类免疫缺陷病毒 1 型 (HIV-1) 基质 (MA) 蛋白和成纤维细胞生长因子受体底物 2α 的脂化缺陷突变体。我们的研究结果表明，这些突变严重破坏了成纤维细胞生长因子受体底物 2α 的 PM 关联，​​但并没有消除它。我们使用 DC z 扫描进一步检测了 HIV-1 MA 与 PM 的结合。有趣的是，我们的数据表明 HIV-1 MA 与 PM 协同结合，解离系数为 Kd ~16 μM，希尔系数为 n ~2。我们使用 DC z 扫描进一步检测了 HIV-1 MA 与 PM 的结合。有趣的是，我们的数据表明 HIV-1 MA 与 PM 协同结合，解离系数为 Kd ~16 μM，希尔系数为 n ~2。我们使用 DC z 扫描进一步检测了 HIV-1 MA 与 PM 的结合。有趣的是，我们的数据表明 HIV-1 MA 与 PM 协同结合，解离系数为 Kd ~16 μM，希尔系数为 n ~2。