Peptide mapping by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) is a common method for characterizing primary sequences of monoclonal antibodies (mAbs) and their post-translational modifications (PTMs). Most methods prepare digests by incubating samples with proteases from several hours to overnight. This often induces artifacts of some modifications such as deamidation and isomerization, resulting in overestimated product-related modifications levels. Hour-long-digestion can generate complicate chromatographic profiles due to semi-cleavages or other unnecessary reactions, interfering with the quantitation of peaks of interest. On the other hand, shortening digestion-time can cause incomplete peptide cleavages, thus low sequence coverage and poor repeatability. This study applied pressure cycling technology (PCT) to tryptic digestion and PNGase F deglycosyaltion. A 0.5-hour PCT assistant tryptic digestion, by alternating cycles of 10-second atmospheric pressure and 50-second high pressure (30 kpsi) at 37 °C, was evaluated and compared with two conventional digestions, 4-hour and 18-hour (i.e., overnight) incubations at 37 °C under atmospheric pressure. The 0.5-hour PCT assistant deglycosylation was also assessed using the same conditions as those by PCT tryptic digestion. The results demonstrated the application of a 0.5-hour PCT to tryptic digestion minimized modification artifacts and reduced interference with quantitation by providing a clean chromatographic profile. The 0.5-hour PCT assistant deglycosylation completely removed the N-glycans from the Asn₃₀₁ in the heavy chains of monoclonal antibody with no impact on the chromatographic profile of the tryptic digests.

通过液相色谱-质谱（LC-MS）进行肽图分析是表征单克隆抗体（mAb）的一级序列及其翻译后修饰（PTM）的常用方法。大多数方法是通过将样品与蛋白酶孵育几个小时到过夜来制备消化物。这通常会引起某些修饰（例如脱酰胺和异构化）的伪影，从而导致高估了与产品相关的修饰水平。一小时的消化会由于半裂解或其他不必要的反应而产生复杂的色谱图，从而干扰目标峰的定量。另一方面，缩短消化时间会导致不完全的肽裂解，从而导致较低的序列覆盖率和较差的重复性。这项研究将压力循环技术（PCT）应用于胰蛋白酶消化和PNGase F去糖基化。通过在37°C下10秒大气压和50秒高压（30 kpsi）交替循环进行的0.5小时PCT辅助胰蛋白酶消化，进行了评估，并将其与两种常规消化4小时和18小时进行了比较（即过夜）在大气压下于37°C孵育。还使用与PCT胰蛋白酶消化相同的条件评估了0.5小时的PCT辅助去糖基化。结果表明，通过提供干净的色谱图谱，将0.5小时的PCT应用到胰蛋白酶消化中可最大程度地减少修饰假象，并减少定量干扰。0.5小时的PCT助手去糖基化反应完全从Asn中去除了N-聚糖 通过在37°C下10秒大气压和50秒高压（30 kpsi）的交替循环，对5小时PCT辅助胰蛋白酶消化进行了评估，并将其与两种常规消化4小时和18小时（即，过夜）在大气压下于37°C下孵育。还使用与PCT胰蛋白酶消化相同的条件评估了0.5小时的PCT辅助去糖基化。结果表明，通过提供干净的色谱图谱，将0.5小时的PCT应用到胰蛋白酶消化中可最大程度地减少修饰假象，并减少定量干扰。0.5小时的PCT助手去糖基化反应完全从Asn中去除了N-聚糖 通过在37°C下10秒大气压和50秒高压（30 kpsi）的交替循环，对5小时PCT辅助胰蛋白酶消化进行了评估，并将其与两种常规消化4小时和18小时（即，过夜）在大气压下于37°C下孵育。还使用与PCT胰蛋白酶消化相同的条件评估了0.5小时的PCT辅助去糖基化。结果表明，通过提供干净的色谱图谱，将0.5小时的PCT应用到胰蛋白酶消化中可最大程度地减少修饰假象，并减少定量干扰。0.5小时的PCT助手去糖基化反应完全从Asn中去除了N-聚糖 评估并与两次常规消化（在大气压力下于37°C孵育4小时和18小时（即过夜））进行比较。还使用与PCT胰蛋白酶消化相同的条件评估了0.5小时的PCT辅助去糖基化。结果表明，通过提供干净的色谱图谱，将0.5小时的PCT应用到胰蛋白酶消化中可最大程度地减少修饰假象，并减少定量干扰。0.5小时的PCT助手去糖基化反应完全从Asn中去除了N-聚糖 评估并与两次常规消化（在大气压力下于37°C孵育4小时和18小时（即过夜））进行比较。还使用与PCT胰蛋白酶消化相同的条件评估了0.5小时的PCT辅助去糖基化。结果表明，通过提供干净的色谱图谱，将0.5小时的PCT应用到胰蛋白酶消化中可最大程度地减少修饰假象，并减少定量干扰。0.5小时的PCT助手去糖基化反应完全从Asn中去除了N-聚糖 5小时的PCT到胰蛋白酶消化可通过提供干净的色谱图来最大程度地减少修饰假象并减少对定量的干扰。0.5小时的PCT助手去糖基化反应完全从Asn中去除了N-聚糖 5小时的PCT到胰蛋白酶消化可通过提供干净的色谱图来最大程度地减少修饰假象，并减少对定量的干扰。0.5小时的PCT助手去糖基化反应完全从Asn中去除了N-聚糖₃₀₁在单克隆抗体的重链中，对胰蛋白酶消化物的色谱图没有影响。