Insect herbivory poses a major threat to maize. Benzoxazinoids are important anti-insect secondary metabolites in maize, whose biosynthetic pathway has been extensively studied. However, yet little is known about how benzoxazinoids are regulated in maize, partly due to lack of mutant resources and recalcitrance to genetic transformation. Transient systems based on mesophyll- or cultured cell-derived protoplasts have been exploited in several plant species and have become a powerful tool for rapid or high-throughput assays of gene functions. Nevertheless, these systems have not been exploited to study the regulation of secondary metabolites. A protocol for isolation of protoplasts from etiolated maize seedlings and efficient transfection was optimized. Furthermore, a 10-min-run-time and highly sensitive HPLC–MS method was established to rapidly detect and quantify maize benzoxazinoids. Coupling maize protoplast transfection and HPLC–MS, we screened a few genes potentially regulating benzoxazinoid biosynthesis using overexpression or silencing by artificial microRNA technology. Combining the power of maize protoplast transfection and HPLC–MS analysis, this method allows rapid screening for the regulatory and biosynthetic genes of maize benzoxazinoids in protoplasts, before the candidates are selected for in planta functional analyses. This method can also be applied to study the biosynthesis and regulation of other secondary metabolites in maize and secondary metabolites in other plant species, including those not amenable to transformation.

中文翻译：

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一种由玉米原生质体转染和 HPLC-MS 组成的高效系统，用于研究玉米苯并恶嗪类的生物合成和调控

昆虫食草对玉米构成重大威胁。苯并恶嗪类是玉米重要的抗虫次生代谢产物，其生物合成途径已被广泛研究。然而，人们对苯并恶嗪类化合物在玉米中的调控方式知之甚少，部分原因是缺乏突变体资源和对遗传转化的抗拒。基于叶肉或培养细胞衍生的原生质体的瞬态系统已在几种植物中得到利用，并已成为快速或高通量检测基因功能的有力工具。然而，这些系统还没有被用来研究次生代谢物的调节。优化了从黄化玉米幼苗中分离原生质体和有效转染的方案。此外，建立了一种 10 分钟运行时间和高灵敏度的 HPLC-MS 方法来快速检测和量化玉米苯并恶嗪类化合物。结合玉米原生质体转染和 HPLC-MS，我们筛选了一些可能通过人工 microRNA 技术过表达或沉默来调节苯并恶嗪类生物合成的基因。结合玉米原生质体转染和 HPLC-MS 分析的能力，该方法可以在选择候选者进行植物功能分析之前，快速筛选原生质体中玉米苯并恶嗪类的调控和生物合成基因。该方法还可用于研究玉米中其他次生代谢物和其他植物物种中次生代谢物的生物合成和调控，包括那些不适合转化的植物。结合玉米原生质体转染和 HPLC-MS，我们筛选了一些可能通过人工 microRNA 技术过表达或沉默来调节苯并恶嗪类生物合成的基因。结合玉米原生质体转染和 HPLC-MS 分析的能力，该方法可以在选择候选者进行植物功能分析之前，快速筛选原生质体中玉米苯并恶嗪类的调控和生物合成基因。该方法还可用于研究玉米中其他次生代谢物和其他植物物种中次生代谢物的生物合成和调控，包括那些不适合转化的植物。结合玉米原生质体转染和 HPLC-MS，我们筛选了一些可能通过人工 microRNA 技术过表达或沉默来调节苯并恶嗪类生物合成的基因。结合玉米原生质体转染和 HPLC-MS 分析的能力，该方法可以在选择候选者进行植物功能分析之前，快速筛选原生质体中玉米苯并恶嗪类的调控和生物合成基因。该方法还可用于研究玉米中其他次生代谢物和其他植物物种中次生代谢物的生物合成和调控，包括那些不适合转化的植物。结合玉米原生质体转染和 HPLC-MS 分析的能力，该方法可以在选择候选者进行植物功能分析之前，快速筛选原生质体中玉米苯并恶嗪类的调控和生物合成基因。该方法还可用于研究玉米中其他次生代谢物和其他植物物种中次生代谢物的生物合成和调控，包括那些不适合转化的植物。结合玉米原生质体转染和 HPLC-MS 分析的能力，该方法可以在选择候选者进行植物功能分析之前，快速筛选原生质体中玉米苯并恶嗪类的调控和生物合成基因。该方法还可用于研究玉米中其他次生代谢物和其他植物物种中次生代谢物的生物合成和调控，包括那些不适合转化的植物。