BACKGROUND Reverse genetics systems enable the manipulation of viral genomes and therefore serve as robust reverse genetic tools to study RNA viruses. A DNA-launched rescue system initiates the transcription of viral genomic cDNA from eukaryotic promoter in transfected cells, generating homogenous RNA transcripts in vitro and thus enhancing virus rescue efficiency. As one of the hazardous pathogens to ducklings, the current knowledge of the pathogenesis of duck astrovirus type 1 (DAstV-1) is limited. The construction of a DNA-launched rescue system can help to accelerate the study of the virus pathogenesis. However, there is no report of such a system for DAstV-1. METHODS In this study, a DNA-launched infectious clone of DAstV-1 was constructed from a cDNA plasmid, which contains a viral cDNA sequence flanked by hammerhead ribozyme (HamRz) and a hepatitis delta virus ribozyme (HdvRz) sequence at both terminals of the viral genome. A silent nucleotide mutation creating a Bgl II site in the ORF2 gene was made to distinguish the rescued virus (rDAstV-1) from the parental virus (pDAstV-1). Immunofluorescence assay (IFA) and western blot were conducted for rescued virus identification in duck embryo fibroblast (DEF) cells pre-treated with trypsin. The growth characteristics of rDAstV-1 and pDAstV-1 in DEF cells and the tissue tropism in 2-day-old ducklings of rDAstV-1 and pDAstV-1 were determined. RESULTS The infectious DAstV-1 was successfully rescued from baby hamster kidney (BHK-21) cells and could propagate in DEF cells pre-treated with 1 μg/ml trypsin. Upon infection of DEF cells pre-treated with trypsin, DAstV-1 mRNA copies were identified after serial passaging, and the result showed that rDAstV-1 and pDAstV-1 shared similar replication kinetics. Animal experiment showed that the rDAstV-1 had an extensive tissue tropism, and the virus was capable of invading both the central and the peripheral immune organs in infected ducklings. CONCLUSIONS An improved DNA-launched reverse genetics system for DAstV-1 was firstly constructed. Infectious virus recovered from BHK-21 cells could propagate in DEF cells pre-treated with trypsin. This is the first report of the successful in vitro cultivation of DAstV-1. We believe this valuable experimental system will contribute to the further study of DAstV-1 genome function and pathogenesis.

中文翻译：

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一种在体外拯救和培养1号鸭星状病毒的新方法。

背景技术反向遗传学系统使得能够操纵病毒基因组，并因此用作研究RNA病毒的可靠的反向遗传学工具。DNA启动的救援系统可从转染的细胞中的真核启动子启动病毒基因组cDNA的转录，在体外产生同质的RNA转录本，从而提高病毒的救援效率。作为小鸭的有害病原体之一，目前对1型鸭星状病毒（DAstV-1）发病机理的认识有限。DNA启动的救援系统的构建可以帮助加速病毒发病机理的研究。但是，没有针对DAstV-1的这种系统的报告。方法在本研究中，从cDNA质粒构建了DNA发射的DAstV-1传染性克隆，它在病毒基因组的两个末端均含有侧翼为锤头状核酶（HamRz）的病毒cDNA序列和丙型肝炎三角洲病毒核酶（HdvRz）序列。进行了沉默的核苷酸突变，在ORF2基因中创建了Bgl II位点，以将营救的病毒（rDAstV-1）与亲本病毒（pDAstV-1）区分开。进行了免疫荧光测定（IFA）和蛋白质印迹，以鉴定用胰蛋白酶预处理的鸭胚成纤维细胞（DEF）细胞中的抢救病毒。测定了rDAstV-1和pDAstV-1在DEF细胞中的生长特性以及2天大的小鸭rDAstV-1和pDAstV-1的组织向性。结果传染性DAstV-1成功地从仓鼠肾（BHK-21）细胞中拯救出来，并可以在用1μg/ ml胰蛋白酶预处理的DEF细胞中繁殖。感染用胰蛋白酶预处理的DEF细胞后，连续传代后鉴定出DAstV-1 mRNA拷贝，结果表明rDAstV-1和pDAstV-1具有相似的复制动力学。动物实验表明，rDAstV-1具有广泛的组织嗜性，该病毒能够侵染被感染小鸭的中央和周围免疫器官。结论首次构建了改进的DAstV-1 DNA发射反向遗传系统。从BHK-21细胞中回收的传染性病毒可以在用胰蛋白酶预处理的DEF细胞中繁殖。这是成功体外培养DAstV-1的第一份报告。我们相信这个有价值的实验系统将有助于DAstV-1基因组功能和发病机理的进一步研究。结果表明，rDAstV-1和pDAstV-1具有相似的复制动力学。动物实验表明，rDAstV-1具有广泛的组织嗜性，该病毒能够侵染被感染小鸭的中央和周围免疫器官。结论首次构建了改良的DAstV-1 DNA发射反向遗传系统。从BHK-21细胞中回收的传染性病毒可以在用胰蛋白酶预处理的DEF细胞中繁殖。这是成功体外培养DAstV-1的第一份报告。我们相信这个有价值的实验系统将有助于DAstV-1基因组功能和发病机理的进一步研究。结果表明，rDAstV-1和pDAstV-1具有相似的复制动力学。动物实验表明，rDAstV-1具有广泛的组织嗜性，该病毒能够侵染被感染小鸭的中央和周围免疫器官。结论首次构建了改良的DAstV-1 DNA发射反向遗传系统。从BHK-21细胞中回收的传染性病毒可以在用胰蛋白酶预处理的DEF细胞中繁殖。这是成功体外培养DAstV-1的第一份报告。我们相信这个有价值的实验系统将有助于DAstV-1基因组功能和发病机理的进一步研究。该病毒能够侵袭被感染小鸭的中枢和外周免疫器官。结论首次构建了改良的DAstV-1 DNA发射反向遗传系统。从BHK-21细胞中回收的传染性病毒可以在用胰蛋白酶预处理的DEF细胞中繁殖。这是成功体外培养DAstV-1的第一份报告。我们相信这个有价值的实验系统将有助于DAstV-1基因组功能和发病机理的进一步研究。该病毒能够侵袭被感染小鸭的中枢和外周免疫器官。结论首次构建了改进的DAstV-1 DNA发射反向遗传系统。从BHK-21细胞中回收的传染性病毒可以在用胰蛋白酶预处理的DEF细胞中繁殖。这是成功体外培养DAstV-1的第一份报告。我们相信这个有价值的实验系统将有助于DAstV-1基因组功能和发病机理的进一步研究。