Resonance assignments are challenging for membrane proteins due to the size of the lipid/detergent-protein complex and the presence of line-broadening from conformational exchange. As a consequence, many correlations are missing in the triple-resonance NMR experiments typically used for assignments. Herein, we present an approach in which correlations from these solution-state NMR experiments are supplemented by data from 13C unlabeling, single-amino acid type labeling, 4D NOESY data and proximity of moieties to lipids or water in combination with a structure of the protein. These additional data are used to edit the expected peaklists for the automated assignment protocol FLYA, a module of the program package CYANA. We demonstrate application of the protocol to the 262-residue proton pump from archaeal bacteriorhodopsin (bR) in lipid nanodiscs. The lipid-protein assembly is characterized by an overall correlation time of 44 ns. The protocol yielded assignments for 62% of all backbone (H, N, Cα, Cβ, C') resonances of bR, corresponding to 74% of all observed backbone spin systems, and 60% of the Ala, Met, Ile (δ1), Leu and Val methyl groups, thus enabling to assign a large fraction of the protein without mutagenesis data. Most missing resonances stem from the extracellular half, likely due intermediate exchange line-broadening. Further analysis revealed that missing information of the amino acid type of the preceding residue is the largest problem, and that 4D NOESY experiments are particularly helpful to compensate for that information loss.

中文翻译：

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细菌视紫红质的骨干和甲基分配纳入纳米光盘。

由于脂质/洗涤剂-蛋白质复合物的大小以及构象交换中存在的线扩展现象，共振分配对于膜蛋白是具有挑战性的。结果，通常用于分配的三共振NMR实验中缺少许多相关性。在这里，我们提出了一种方法，其中这些溶液状态NMR实验的相关性由13C非标记，单氨基酸类型标记，4D NOESY数据以及部分与脂质或水的结合以及蛋白质结构的数据补充。这些附加数据用于编辑自动分配协议FLYA（程序包CYANA的模块）的预期峰列表。我们展示了协议从脂质纳米圆盘中的古细菌细菌视紫红质（bR）到262残留质子泵的应用。脂质-蛋白质组装的特征是总相关时间为44 ns。该协议对bR的所有骨架（H，N，Cα，Cβ，C'）共振产生62％的分配，对应于所有观察到的骨架自旋系统的74％和Ala，Met，Ile（δ1）的60％ ，Leu和Val甲基，因此无需诱变数据即可分配大部分蛋白质。大多数丢失的共振来自细胞外的一半，可能是由于中间交换线变宽所致。进一步的分析表明，先前残基氨基酸类型的信息丢失是最大的问题，而4D NOESY实验特别有助于弥补该信息丢失。bR的Cα，Cβ，C'）共振，对应于所有观察到的主链自旋系统的74％，以及Ala，Met，Ile（δ1），Leu和Val甲基的60％，因此能够分配很大一部分没有诱变数据的蛋白质。大多数丢失的共振来自细胞外的一半，可能是由于中间交换线变宽所致。进一步的分析表明，先前残基氨基酸类型的信息丢失是最大的问题，而4D NOESY实验特别有助于弥补该信息丢失。bR的Cα，Cβ，C'）共振，对应于所有观察到的主链自旋系统的74％，以及Ala，Met，Ile（δ1），Leu和Val甲基的60％，因此能够分配很大一部分没有诱变数据的蛋白质。大多数丢失的共振来自细胞外的一半，可能是由于中间交换线变宽所致。进一步的分析表明，先前残基氨基酸类型的信息丢失是最大的问题，而4D NOESY实验特别有助于弥补该信息丢失。大多数丢失的共振来自细胞外的一半，可能是由于中间交换线变宽所致。进一步的分析表明，先前残基氨基酸类型的信息丢失是最大的问题，而4D NOESY实验特别有助于弥补该信息丢失。大多数丢失的共振来自细胞外的一半，可能是由于中间交换线变宽所致。进一步的分析表明，先前残基氨基酸类型的信息丢失是最大的问题，而4D NOESY实验特别有助于弥补该信息丢失。