We analyzed the skeletal phenotypes of heterozygous null Cyp27b1 (Cyp27b1+/- ) mice and their wild-type (WT) littermates to determine whether haploinsufficiency of Cyp27b1 accelerated bone loss, and to examine potential mechanisms of such loss. We found that serum 1,25-dihydroxyvitamin D [1,25(OH)2 D] levels were significantly decreased in aging Cyp27b1+/- mice, which displayed an osteoporotic phenotype. This was accompanied by a reduction of expression of the B lymphoma Moloney murine leukemia virus (Mo-MLV) insertion region 1 (Bmi1) at both gene and protein levels. Using chromatin immunoprecipitation (ChIP)-PCR, electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and a luciferase reporter assay, we then showed that 1,25(OH)2 D3 upregulated Bmi1 expression at a transcriptional level via the vitamin D receptor (VDR). To determine whether Bmi1 overexpression in mesenchymal stem cells (MSCs) could correct bone loss induced by 1,25(OH)2 D deficiency, we overexpressed Bmi1 in MSCs using Prx1-driven Bmi1 transgenic mice (Bmi1Tg ) mice. We then compared the bone phenotypes of Bmi1Tg mice on a Cyp27b1+/- background, with those of Cyp27b1+/- mice and with those of WT mice, all at 8 months of age. We found that overexpression of Bmi1 in MSCs corrected the bone phenotype of Cyp27b1+/- mice by increasing osteoblastic bone formation, reducing osteoclastic bone resorption, increasing bone volume, and increasing bone mineral density. Bmi1 overexpression in MSCs also corrected 1,25(OH)2 D deficiency-induced oxidative stress and DNA damage, and cellular senescence of Cyp27b1+/- mice by reducing levels of reactive oxygen species (ROS), elevating serum total superoxide dismutase levels, reducing the percentage of γH2 A.X, p16, IL-1β, and TNF-α-positive cells and decreasing γH2A.X, p16, p19, p53, p21, IL-1β, and IL-6 expression levels. Furthermore, 1,25(OH)2 D stimulated the osteogenic differentiation of MSCs, both ex vivo and in vitro, from WT mice but not from Bmi1-/- mice and 1,25(OH)2 D administration in vivo increased osteoblastic bone formation in WT, but not in Bmi1 -/- mice. Our results indicate that Bmi1, a key downstream target of 1,25(OH)2 D, plays a crucial role in preventing bone loss induced by 1,25(OH)2 D deficiency. © 2019 American Society for Bone and Mineral Research.

中文翻译：

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Polycomb 蛋白 Bmi1 在预防 1,25(OH)2 D 缺乏引起的骨丢失中起着至关重要的作用。

我们分析了杂合无效 Cyp27b1 (Cyp27b1+/-) 小鼠及其野生型 (WT) 同窝小鼠的骨骼表型，以确定 Cyp27b1 的单倍体不足是否会加速骨丢失，并检查这种丢失的潜在机制。我们发现，在老化的 Cyp27b1+/- 小鼠中，血清 1,25-二羟基维生素 D [1,25(OH)2 D] 水平显着降低，表现为骨质疏松表型。这伴随着 B 淋巴瘤莫洛尼鼠白血病病毒 (Mo-MLV) 插入区 1 (Bmi1) 在基因和蛋白质水平上的表达减少。使用染色质免疫沉淀 (ChIP)-PCR、电泳迁移率变动分析 (EMSA) 和荧光素酶报告基因分析，我们发现 1,25(OH)2 D3 通过维生素 D 受体 (VDR) 在转录水平上调 Bmi1 表达。为了确定间充质干细胞 (MSCs) 中的 Bmi1 过表达是否可以纠正由 1,25(OH)2 D 缺乏引起的骨丢失，我们使用 Prx1 驱动的 Bmi1 转基因小鼠 (Bmi1Tg) 小鼠在 MSCs 中过表达 Bmi1。然后，我们比较了 Cyp27b1+/- 背景下 Bmi1Tg 小鼠的骨表型、Cyp27b1+/- 小鼠和 WT 小鼠的骨表型，均在 8 个月大。我们发现，MSCs 中 Bmi1 的过表达通过增加成骨细胞骨形成、减少破骨细胞骨吸收、增加骨体积和增加骨矿物质密度来纠正 Cyp27b1+/- 小鼠的骨表型。MSCs 中的 Bmi1 过表达还通过降低活性氧 (ROS) 水平来纠正 1,25(OH)2 D 缺乏诱导的氧化应激和 DNA 损伤，以及 Cyp27b1+/- 小鼠的细胞衰老，提高血清总超氧化物歧化酶水平，降低 γH2 AX、p16、IL-1β 和 TNF-α 阳性细胞的百分比并降低 γH2A.X、p16、p19、p53、p21、IL-1β 和 IL-6 的表达水平。此外，1,25(OH)2 D 刺激了来自 WT 小鼠但不来自 Bmi1-/- 小鼠的 MSCs 在离体和体外的成骨分化，并且在体内施用 1,25(OH)2D 增加了成骨细胞骨在 WT 中形成，但在 Bmi1 -/- 小鼠中没有。我们的研究结果表明，Bmi1 是 1,25(OH)2 D 的关键下游靶标，在预防 1,25(OH)2 D 缺乏引起的骨质流失中起着至关重要的作用。© 2019 美国骨与矿物研究学会。25(OH)2 D 刺激了来自 WT 小鼠而非 Bmi1-/- 小鼠的离体和体外 MSCs 的成骨分化，并且在体内施用 1,25(OH)2 D 增加了 WT 中的成骨细胞骨形成，但不在 Bmi1 -/- 小鼠中。我们的研究结果表明，Bmi1 是 1,25(OH)2 D 的关键下游靶标，在预防 1,25(OH)2 D 缺乏引起的骨质流失中起着至关重要的作用。© 2019 美国骨与矿物研究学会。25(OH)2 D 刺激了来自 WT 小鼠而非 Bmi1-/- 小鼠的离体和体外 MSCs 的成骨分化，并且在体内施用 1,25(OH)2 D 增加了 WT 中的成骨细胞骨形成，但不在 Bmi1 -/- 小鼠中。我们的研究结果表明，Bmi1 是 1,25(OH)2 D 的关键下游靶标，在预防 1,25(OH)2 D 缺乏引起的骨质流失中起着至关重要的作用。© 2019 美国骨与矿物研究学会。