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Iron chelator Deferoxamine protects human neuroblastoma cell line SH-SY5Y from 6-Hydroxydopamine-induced apoptosis and autophagy dysfunction.
Journal of Trace Elements in Medicine and Biology ( IF 3.6 ) Pub Date : 2019-09-20 , DOI: 10.1016/j.jtemb.2019.126406 Jyotirmoy Rakshit 1 , Ayushi Priyam 1 , Karthik Kumar Gowrishetty 1 , Sudhanshu Mishra 1 , Jaya Bandyopadhyay 1
Journal of Trace Elements in Medicine and Biology ( IF 3.6 ) Pub Date : 2019-09-20 , DOI: 10.1016/j.jtemb.2019.126406 Jyotirmoy Rakshit 1 , Ayushi Priyam 1 , Karthik Kumar Gowrishetty 1 , Sudhanshu Mishra 1 , Jaya Bandyopadhyay 1
Affiliation
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BACKGROUND
Intracellular iron involves in Fenton's reaction-mediated Hydroxyl radical (OH·) generation by reacting with the neurotoxic agent 6-Hydroxydopamine (6-OHDA) autoxidation derivative Hydrogen Peroxide (H2O2). Several studies have been conducted so far on the neuroprotective activities of the iron chelator Deferoxamine (DFO) but little or no clear evidence about the underlying cellular mechanism is available.
METHODS
The present study was conducted on Human neuroblastoma cell line SH-SY5Y in the absence or presence of 6-OHDA or H2O2 and / or DFO. Following incubation, cell viability assay, intracellular reactive oxygen species (ROS) determination, flow cytometric quantification of apoptotic cells followed by nuclear staining, intracellular tracking of transfected fusion construct of microtubule-associated protein 1B-light chain with Green fluorescent protein - Red fluorescent protein (LC3B-GFP-RFP reporters) and immunocytochemistry of intracellular Cathepsin protein by confocal microscopy, were conducted. In addition, western blotting was carried out to detect expressions of apoptotic and autophagy related proteins.
RESULTS
This study confirmed the neuroprotective potential of DFO by inhibiting 6-OHDA-mediated cell death and ROS generation. Reduced percentage of apoptotic cells and appearance of altered nuclei architecture followed by a reduced expression of cleaved PARP (Poly-ADP-ribose Polymerase) and cleaved Caspase-3 were observed upon DFO treatment against 6-OHDA, and as well as against H2O2 in SH-SY5Y cell lines. Besides, DFO induced the intracellular autophagolysosome formation (red puncta) rather than autophagosome (yellow puncta) only. Thereafter it was observed that DFO restored the expression of intracellular lysosomal protease Cathepsin and reduced the expression of the LC3-II.
CONCLUSION
Taken together, this study clearly demonstrated that the anti-Fenton activity of DFO inhibited apoptosis and caused blockade in ALP or autophagy dysfunction in SH-SY5Y cell lines. These outcomes further suggest that DFO provides neuroprotection by inhibiting apoptosis and inducing the progression of Autophagy- lysosomal pathway (ALP).
中文翻译：
铁螯合剂去铁胺保护人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y免受6-羟基多巴胺诱导的细胞凋亡和自噬功能障碍。
背景技术胞内铁通过与神经毒性剂6-羟基多巴胺（6-OHDA）自氧化衍生物过氧化氢（H2O2）反应，参与芬顿反应介导的羟自由基（OH·）的产生。迄今为止，已经对铁螯合剂去铁胺（DFO）的神经保护活性进行了几项研究，但几乎没有或没有关于潜在细胞机制的明确证据。方法本研究是在不存在或存在6-OHDA或H2O2和/或DFO的情况下，对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y进行的。孵育，细胞活力测定，细胞内活性氧（ROS）测定，凋亡细胞的流式细胞仪定量，然后进行核染色，通过共聚焦显微镜对转染的微管相关蛋白1B-轻链与绿色荧光蛋白-红色荧光蛋白（LC3B-GFP-RFP报告基因）的融合构建体进行了细胞内跟踪和细胞内组织蛋白酶蛋白的免疫细胞化学分析。另外，进行了蛋白质印迹法以检测凋亡和自噬相关蛋白的表达。结果本研究通过抑制6-OHDA介导的细胞死亡和ROS生成，证实了DFO的神经保护潜力。DFO处理6-OHDA和SH中的H2O2时，观察到凋亡细胞的百分比降低和核结构改变的出现，随后裂解的PARP（多聚ADP-核糖聚合酶）和裂解的Caspase-3的表达降低。 -SY5Y细胞系。除了，DFO仅诱导细胞内自噬体的形成（红色点），而不是自噬体（黄色的点）。此后，观察到DFO恢复了细胞内溶酶体蛋白酶组织蛋白酶的表达并降低了LC3-II的表达。结论综上所述，本研究清楚地证明了DFO的抗Fenton活性可抑制SH-SY5Y细胞系的凋亡并引起ALP阻滞或自噬功能障碍。这些结果进一步表明，DFO通过抑制细胞凋亡并诱导自噬溶酶体途径（ALP）来提供神经保护作用。结论综上所述，本研究清楚地证明了DFO的抗Fenton活性可抑制SH-SY5Y细胞系的凋亡并引起ALP阻滞或自噬功能障碍。这些结果进一步表明，DFO通过抑制细胞凋亡并诱导自噬溶酶体途径（ALP）来提供神经保护作用。结论综上所述，本研究清楚地证明了DFO的抗Fenton活性可抑制SH-SY5Y细胞系的凋亡并引起ALP阻滞或自噬功能障碍。这些结果进一步表明，DFO通过抑制细胞凋亡并诱导自噬溶酶体途径（ALP）来提供神经保护作用。
更新日期：2019-09-21
中文翻译：
铁螯合剂去铁胺保护人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y免受6-羟基多巴胺诱导的细胞凋亡和自噬功能障碍。
背景技术胞内铁通过与神经毒性剂6-羟基多巴胺（6-OHDA）自氧化衍生物过氧化氢（H2O2）反应，参与芬顿反应介导的羟自由基（OH·）的产生。迄今为止，已经对铁螯合剂去铁胺（DFO）的神经保护活性进行了几项研究，但几乎没有或没有关于潜在细胞机制的明确证据。方法本研究是在不存在或存在6-OHDA或H2O2和/或DFO的情况下，对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y进行的。孵育，细胞活力测定，细胞内活性氧（ROS）测定，凋亡细胞的流式细胞仪定量，然后进行核染色，通过共聚焦显微镜对转染的微管相关蛋白1B-轻链与绿色荧光蛋白-红色荧光蛋白（LC3B-GFP-RFP报告基因）的融合构建体进行了细胞内跟踪和细胞内组织蛋白酶蛋白的免疫细胞化学分析。另外，进行了蛋白质印迹法以检测凋亡和自噬相关蛋白的表达。结果本研究通过抑制6-OHDA介导的细胞死亡和ROS生成，证实了DFO的神经保护潜力。DFO处理6-OHDA和SH中的H2O2时，观察到凋亡细胞的百分比降低和核结构改变的出现，随后裂解的PARP（多聚ADP-核糖聚合酶）和裂解的Caspase-3的表达降低。 -SY5Y细胞系。除了，DFO仅诱导细胞内自噬体的形成（红色点），而不是自噬体（黄色的点）。此后，观察到DFO恢复了细胞内溶酶体蛋白酶组织蛋白酶的表达并降低了LC3-II的表达。结论综上所述，本研究清楚地证明了DFO的抗Fenton活性可抑制SH-SY5Y细胞系的凋亡并引起ALP阻滞或自噬功能障碍。这些结果进一步表明，DFO通过抑制细胞凋亡并诱导自噬溶酶体途径（ALP）来提供神经保护作用。结论综上所述，本研究清楚地证明了DFO的抗Fenton活性可抑制SH-SY5Y细胞系的凋亡并引起ALP阻滞或自噬功能障碍。这些结果进一步表明，DFO通过抑制细胞凋亡并诱导自噬溶酶体途径（ALP）来提供神经保护作用。结论综上所述，本研究清楚地证明了DFO的抗Fenton活性可抑制SH-SY5Y细胞系的凋亡并引起ALP阻滞或自噬功能障碍。这些结果进一步表明，DFO通过抑制细胞凋亡并诱导自噬溶酶体途径（ALP）来提供神经保护作用。
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