Simultaneous enrichment of glyco- and phosphopeptides will benefit the studies of biological processes regulated by these posttranslational modifications (PTMs). It will also reveal potential crosstalk between these two ubiquitous PTMs. Unlike custom-designed multifunctional solid phase extraction (SPE) materials, operating strong anion exchange (SAX) resin in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography (ERLIC) mode provides a readily available strategy to analytical labs for enrichment of these PTMs for subsequent mass spectrometry (MS)-based characterization. However, the choice of mobile phase has largely relied on empirical rules from hydrophilic interaction chromatography (HILIC) or ion-exchange chromatography (IEX) without further optimization and adjustments. In this study, ten mobile phase compositions of ERLIC were systematically compared; the impact of multiple factors including organic phase proportion, ion pairing reagent, pH, and salt on the retention of glycosylated and phosphorylated peptides was evaluated. This study demonstrated good enrichment of glyco- and phosphopeptides from the nonmodified peptides in a complex tryptic digest. Moreover, the enriched glyco- and phosphopeptides elute in different fractions by orthogonal retention mechanisms of hydrophilic interaction and electrostatic interaction in ERLIC, maximizing the LC-MS identification of each PTM. The optimized mobile phase can be adapted to the ERLIC HPLC system, where the high resolution in separating multiple PTMs will benefit large-scale MS-based PTM profiling and in-depth characterization.

中文翻译：

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在 ERLIC 流动相中寻找同时富集 N-糖和磷酸肽的最佳位置。

同时富集糖肽和磷酸肽将有益于受这些翻译后修饰 (PTM) 调控的生物过程的研究。它还将揭示这两个无处不在的 PTM 之间的潜在串扰。与定制设计的多功能固相萃取 (SPE) 材料不同，在静电排斥-亲水相互作用色谱 (ERLIC) 模式下操作强阴离子交换 (SAX) 树脂为分析实验室提供了一种现成的策略，用于富集这些 PTM 以进行后续质谱分析。基于 MS) 的表征。然而，流动相的选择很大程度上依赖于亲水相互作用色谱 (HILIC) 或离子交换色谱 (IEX) 的经验规则，而没有进一步优化和调整。在这项研究中，系统地比较了 ERLIC 的十种流动相组成；评估了有机相比例、离子对试剂、pH 和盐等多种因素对糖基化和磷酸化肽保留的影响。该研究表明，在复杂的胰蛋白酶消化物中，未修饰的肽能够很好地富集糖肽和磷酸肽。此外，通过 ERLIC 中亲水相互作用和静电相互作用的正交保留机制，富集的糖肽和磷酸肽在不同馏分中洗脱，最大限度地提高了对每个 PTM 的 LC-MS 鉴定。优化后的流动相可适用于 ERLIC HPLC 系统，其中分离多个 PTM 的高分辨率将有利于大规模基于 MS 的 PTM 分析和深入表征。评估了有机相比例、离子对试剂、pH 和盐等多种因素对糖基化和磷酸化肽保留的影响。该研究表明，在复杂的胰蛋白酶消化物中，未修饰的肽能够很好地富集糖肽和磷酸肽。此外，通过 ERLIC 中亲水相互作用和静电相互作用的正交保留机制，富集的糖肽和磷酸肽在不同馏分中洗脱，最大限度地提高了对每个 PTM 的 LC-MS 鉴定。优化后的流动相可适用于 ERLIC HPLC 系统，其中分离多个 PTM 的高分辨率将有利于大规模基于 MS 的 PTM 分析和深入表征。评估了有机相比例、离子对试剂、pH 和盐等多种因素对糖基化和磷酸化肽保留的影响。该研究表明，在复杂的胰蛋白酶消化物中，未修饰的肽能够很好地富集糖肽和磷酸肽。此外，富集的糖肽和磷酸肽通过 ERLIC 中亲水相互作用和静电相互作用的正交保留机制在不同馏分中洗脱，最大限度地提高了每个 PTM 的 LC-MS 鉴定。优化后的流动相可适用于 ERLIC HPLC 系统，其中分离多个 PTM 的高分辨率将有利于大规模基于 MS 的 PTM 分析和深入表征。和盐对糖基化和磷酸化肽的保留进行了评估。该研究表明，在复杂的胰蛋白酶消化物中，未修饰的肽能够很好地富集糖肽和磷酸肽。此外，通过 ERLIC 中亲水相互作用和静电相互作用的正交保留机制，富集的糖肽和磷酸肽在不同馏分中洗脱，最大限度地提高了对每个 PTM 的 LC-MS 鉴定。优化后的流动相可适用于 ERLIC HPLC 系统，其中分离多个 PTM 的高分辨率将有利于大规模基于 MS 的 PTM 分析和深入表征。和盐对糖基化和磷酸化肽的保留进行了评估。该研究表明，在复杂的胰蛋白酶消化物中，未修饰的肽能够很好地富集糖肽和磷酸肽。此外，富集的糖肽和磷酸肽通过 ERLIC 中亲水相互作用和静电相互作用的正交保留机制在不同馏分中洗脱，最大限度地提高了每个 PTM 的 LC-MS 鉴定。优化后的流动相可适用于 ERLIC HPLC 系统，其中分离多个 PTM 的高分辨率将有利于大规模基于 MS 的 PTM 分析和深入表征。通过 ERLIC 中亲水相互作用和静电相互作用的正交保留机制，富集的糖肽和磷酸肽在不同的馏分中洗脱，最大限度地提高了对每个 PTM 的 LC-MS 鉴定。优化后的流动相可适用于 ERLIC HPLC 系统，其中分离多个 PTM 的高分辨率将有利于大规模基于 MS 的 PTM 分析和深入表征。通过 ERLIC 中亲水相互作用和静电相互作用的正交保留机制，富集的糖肽和磷酸肽在不同的馏分中洗脱，最大限度地提高了对每个 PTM 的 LC-MS 鉴定。优化后的流动相可适用于 ERLIC HPLC 系统，其中分离多个 PTM 的高分辨率将有利于大规模基于 MS 的 PTM 分析和深入表征。