BACKGROUND Several types of phospholipases have been described in phospholipids modification. The majority of phospholipase D (PLD) superfamily members can catalyze two separate reactions: the hydrolysis of phospholipids to produce phosphatidic acid (PA) and the transphosphatidylation of phosphatidyl groups into various phosphatidyl alcohols to produce modified phospholipids. Transphosphatidylation is a useful biocatalytic method for the synthesis of functional phospholipids from lecithin or phosphatidylcholine (PC), which are both easily accessible. Different PLD coding genes have been cloned from various sources from viral, prokaryotic, and eukaryotic organisms. Despite the catalytic potential of PLD, their low productivity has hampered their practical applications, probably because PLD, which is highly toxic to the host cells, when transformation of the PLD genes into the host cells, degrade PLs in the cell membrane. In this study, we designed a novel two-step expression system to produce and secrete recombinant PLD in extracellular medium, cellulose-binding domains as an affinity fused with PLD for immobilization and purification proteins. RESULTS The engineered BL21 (DE3) host strain, which harbored the final expression vector pET28a-PLD-CBD-araC-ESN, was induced by IPTG and L-arabinose, the cell density decreased rapidly over a 2 h period and the enzymes released into the extracellular medium accounts owned 81.75% hydrolytic activity. Scanning electron microscopy results showed that there were obvious structural changes on the cell surface. The extracellularly secreted PLD-CBD powder was used to catalyze the transphosphatidylation reaction synthesis of phosphatidylserine, 2.3 U enzymes reacted for 12 h, during which the conversion rate reached 99% with very few by-products being produced. When the fused protein PLD-CBD immobilized on microcrystalline cellulose, the enzymes can be cycle used five times with 26% conversion rate was preserved. CONCLUSIONS This study introduced an effective method for use in the expression of recombinant proteins and their extracellular secretion that simplifies the steps of sonication and purification and demonstrates great potential in the industrial application of enzymes. Cellulose as the most abundant renewable biomass resources in nature, and the cost is low, used for PLD immobilization make it more simple, effective and sustainable.

中文翻译：

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一种新颖的自溶系统，用于细胞外生产和与纤维素结合域融合的磷脂酶D的直接固定化。

背景技术在磷脂修饰中已经描述了几种类型的磷脂酶。磷脂酶D（PLD）的大多数超家族成员可以催化两个独立的反应：磷脂水解产生磷脂酸（PA），磷脂酰化磷脂酰化为各种磷脂酰醇，从而产生修饰的磷脂。转磷脂酰化是一种有用的生物催化方法，用于从卵磷脂或磷脂酰胆碱（PC）合成功能性磷脂，它们都易于获得。从病毒，原核和真核生物的各种来源已经克隆了不同的PLD编码基因。尽管PLD具有催化潜力，但它们的低生产率仍然妨碍了其实际应用，这可能是因为对宿主细胞有剧毒的PLD 当PLD基因转化为宿主细胞时，降解细胞膜中的PL。在这项研究中，我们设计了一种新颖的两步表达系统，以在细胞外培养基中产生和分泌重组PLD，纤维素结合域作为与PLD融合的亲和力用于固定和纯化蛋白质。结果IPTG和L-阿拉伯糖诱导了携带最终表达载体pET28a-PLD-CBD-araC-ESN的工程BL21（DE3）宿主菌株，在2 h内细胞密度迅速下降，酶释放到细胞外介质具有81.75％的水解活性。扫描电子显微镜结果表明，细胞表面有明显的结构变化。细胞外分泌的PLD-CBD粉末用于催化磷脂酰丝氨酸的转磷脂酰化反应合成，2.3 U酶反应12 h，在此期间转化率达到99％，副产物很少。当融合蛋白PLD-CBD固定在微晶纤维素上时，该酶可以循环使用5次，转化率保持在26％。结论这项研究为重组蛋白的表达及其细胞外分泌提供了一种有效的方法，该方法简化了超声处理和纯化步骤，并在酶的工业应用中显示出巨大的潜力。纤维素作为自然界中最丰富的可再生生物质资源，且成本低廉，用于PLD固定化使其更加简单，有效和可持续。3 U酶反应12小时，在此期间转化率达到99％，几乎不产生副产物。当融合蛋白PLD-CBD固定在微晶纤维素上时，该酶可以循环使用5次，转化率保持在26％。结论这项研究为重组蛋白的表达及其细胞外分泌提供了一种有效的方法，该方法简化了超声处理和纯化步骤，并在酶的工业应用中显示出巨大的潜力。纤维素作为自然界中最丰富的可再生生物质资源，且成本低廉，用于PLD固定化使其更加简单，有效和可持续。3 U酶反应12小时，在此期间转化率达到99％，几乎不产生副产物。当融合蛋白PLD-CBD固定在微晶纤维素上时，该酶可以循环使用5次，转化率保持在26％。结论这项研究为重组蛋白的表达及其细胞外分泌提供了一种有效的方法，该方法简化了超声处理和纯化步骤，并在酶的工业应用中显示出巨大的潜力。纤维素作为自然界中最丰富的可再生生物质资源，且成本低廉，用于PLD固定化使其更加简单，有效和可持续。当融合蛋白PLD-CBD固定在微晶纤维素上时，该酶可以循环使用5次，转化率保持在26％。结论这项研究为重组蛋白的表达及其细胞外分泌提供了一种有效的方法，该方法简化了超声处理和纯化步骤，并在酶的工业应用中显示出巨大的潜力。纤维素作为自然界中最丰富的可再生生物质资源，且成本低廉，用于PLD固定化使其更加简单，有效和可持续。当融合蛋白PLD-CBD固定在微晶纤维素上时，该酶可以循环使用5次，转化率保持在26％。结论这项研究为重组蛋白的表达及其细胞外分泌提供了一种有效的方法，该方法简化了超声处理和纯化步骤，并在酶的工业应用中显示出巨大的潜力。纤维素作为自然界中最丰富的可再生生物质资源，且成本低廉，用于PLD固定化使其更加简单，有效和可持续。结论这项研究为重组蛋白的表达及其细胞外分泌提供了一种有效的方法，该方法简化了超声处理和纯化步骤，并在酶的工业应用中显示出巨大的潜力。纤维素作为自然界中最丰富的可再生生物质资源，且成本低廉，用于PLD固定化使其更加简单，有效和可持续。结论这项研究为重组蛋白的表达及其细胞外分泌提供了一种有效的方法，该方法简化了超声处理和纯化的步骤，并在酶的工业应用中显示出巨大的潜力。纤维素作为自然界中最丰富的可再生生物质资源，且成本低廉，用于PLD固定化使其更加简单，有效和可持续。