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Accelerated genome engineering of Pseudomonas putida by I-SceI-mediated recombination and CRISPR-Cas9 counterselection.
Microbial Biotechnology ( IF 4.8 ) Pub Date : 2019-03-12 , DOI: 10.1111/1751-7915.13396 Nicolas T Wirth 1 , Ekaterina Kozaeva 1 , Pablo I Nikel 1
Microbial Biotechnology ( IF 4.8 ) Pub Date : 2019-03-12 , DOI: 10.1111/1751-7915.13396 Nicolas T Wirth 1 , Ekaterina Kozaeva 1 , Pablo I Nikel 1
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Pseudomonas species have become reliable platforms for bioproduction due to their capability to tolerate harsh conditions imposed by large‐scale bioprocesses and their remarkable resistance to diverse physicochemical stresses. The last few years have brought forth a variety of synthetic biology tools for the genetic manipulation of pseudomonads, but most of them are either applicable only to obtain certain types of mutations, lack efficiency, or are not easily accessible to be used in different Pseudomonas species (e.g. natural isolates). In this work, we describe a versatile, robust and user‐friendly procedure that facilitates virtually any kind of genomic manipulation in Pseudomonas species in 3–5 days. The protocol presented here is based on DNA recombination forced by double‐stranded DNA cuts (through the activity of the I‐SceI homing meganuclease from yeast) followed by highly efficient counterselection of mutants (aided by a synthetic CRISPR‐Cas9 device). The individual parts of the genome engineering toolbox, tailored for knocking genes in and out, have been standardized to enable portability and easy exchange of functional gene modules as needed. The applicability of the procedure is illustrated both by eliminating selected genomic regions in the platform strain P. putida KT2440 (including difficult‐to‐delete genes) and by integrating different reporter genes (comprising novel variants of fluorescent proteins) into a defined landing site in the target chromosome.
中文翻译：
通过 I-SceI 介导的重组和 CRISPR-Cas9 反选择加速恶臭假单胞菌的基因组工程。
假单胞菌属物种因其能够耐受大规模生物过程所施加的恶劣条件以及对各种物理化学应激的显着抵抗力而成为可靠的生物生产平台。过去几年出现了多种用于假单胞菌基因操作的合成生物学工具，但大多数工具要么仅适用于获得某些类型的突变，缺乏效率，要么不易用于不同的假单胞菌物种（例如天然分离物）。在这项工作中，我们描述了一种多功能、强大且用户友好的程序，可在 3-5 天内促进假单胞菌属物种中几乎任何类型的基因组操作。这里介绍的协议基于双链 DNA 切割（通过来自酵母的 I- Sce I 归巢大范围核酸酶的活性）强制进行的 DNA 重组，然后对突变体进行高效反选择（在合成 CRISPR-Cas9 装置的帮助下）。基因组工程工具箱的各个部分专为敲入和敲出基因而定制，已经标准化，以便根据需要实现功能基因模块的可移植性和轻松交换。该程序的适用性通过消除平台菌株恶臭假单胞菌KT2440 中的选定基因组区域（包括难以删除的基因）和通过将不同的报告基因（包括荧光蛋白的新变体）整合到确定的着陆位点来说明。目标染色体。
更新日期：2019-03-12
中文翻译：
通过 I-SceI 介导的重组和 CRISPR-Cas9 反选择加速恶臭假单胞菌的基因组工程。
假单胞菌属物种因其能够耐受大规模生物过程所施加的恶劣条件以及对各种物理化学应激的显着抵抗力而成为可靠的生物生产平台。过去几年出现了多种用于假单胞菌基因操作的合成生物学工具，但大多数工具要么仅适用于获得某些类型的突变，缺乏效率，要么不易用于不同的假单胞菌物种（例如天然分离物）。在这项工作中，我们描述了一种多功能、强大且用户友好的程序，可在 3-5 天内促进假单胞菌属物种中几乎任何类型的基因组操作。这里介绍的协议基于双链 DNA 切割（通过来自酵母的 I- Sce I 归巢大范围核酸酶的活性）强制进行的 DNA 重组，然后对突变体进行高效反选择（在合成 CRISPR-Cas9 装置的帮助下）。基因组工程工具箱的各个部分专为敲入和敲出基因而定制，已经标准化，以便根据需要实现功能基因模块的可移植性和轻松交换。该程序的适用性通过消除平台菌株恶臭假单胞菌KT2440 中的选定基因组区域（包括难以删除的基因）和通过将不同的报告基因（包括荧光蛋白的新变体）整合到确定的着陆位点来说明。目标染色体。
京公网安备 11010802027423号