Continuous-wave and pulsed electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy have been used to characterize two variants of bacterial sulfite dehydrogenase (SDH) from Starkeya novella in which the conserved active-site arginine residue (R55) is replaced by a neutral amino acid residue. Substitution by the hydrophobic methionine residue (SDH(R55M)) has essentially no effect on the pH dependence of the EPR properties of the Mo(V) center, even though the X-ray structure of this variant shows that the methionine residue is rotated away from the Mo center and a sulfate anion is present in the active-site pocket (Bailey et al. in J Biol Chem 284:2053-2063, 2009). For SDH(R55M) only the high-pH form is observed, and samples prepared in H(2)(17)O-enriched buffer show essentially the same (17)O hyperfine interaction and nuclear quadrupole interaction parameters as SDH(WT) enzyme. However, the pH dependence of the EPR spectra of SDH(R55Q), in which the positively charged arginine is replaced by the neutral hydrophilic glutamine, differs significantly from that of SDH(WT). For SDH(R55Q) the blocked form with bound sulfate is generated at low pH, as verified by (33)S couplings observed upon reduction with (33)S-labeled sulfite. This observation of bound sulfate for SDH(R55Q) supports our previous hypothesis that sulfite-oxidizing enzymes can exhibit multiple pathways for electron transfer and product release (Emesh et al. in Biochemistry 48:2156-2163, 2009). At pH > or = 8 the high-pH form dominates for SDH(R55Q).

中文翻译：

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对来自 Starkeya Novella 的亚硫酸盐脱氢酶的 R55Q 和 R55M 变体的 Mo(V) 中心的脉冲 EPR 研究。

连续波和脉冲电子顺磁共振 (EPR) 光谱已被用于表征来自 Starkeya Novella 的细菌亚硫酸盐脱氢酶 (SDH) 的两种变体，其中保守的活性位点精氨酸残基 (R55) 被中性氨基酸残基取代。疏水性甲硫氨酸残基 (SDH(R55M)) 的取代对 Mo(V) 中心的 EPR 特性的 pH 依赖性基本上没有影响，即使该变体的 X 射线结构显示甲硫氨酸残基旋转离开来自 Mo 中心的硫酸根阴离子存在于活性位点袋中（Bailey 等人在 J Biol Chem 284:2053-2063, 2009 中）。对于 SDH(R55M)，仅观察到高 pH 形式，在富含 H(2)(17)O 的缓冲液中制备的样品显示出与 SDH(WT) 酶基本相同的 (17)O 超精细相互作用和核四极杆相互作用参数。然而，其中带正电荷的精氨酸被中性亲水性谷氨酰胺取代的 SDH(R55Q) 的 EPR 光谱的 pH 依赖性与 SDH(WT) 的显着不同。对于 SDH(R55Q)，结合硫酸盐的封闭形式是在低 pH 值下生成的，正如在用 (33)S 标记的亚硫酸盐还原时观察到的 (33)S 偶联所证实的那样。对 SDH(R55Q) 结合硫酸盐的这一观察结果支持我们之前的假设，即亚硫酸盐氧化酶可以表现出多种电子转移和产物释放途径（Emesh 等，Biochemistry 48:2156-2163, 2009）。在 pH > 或 = 8 时，高 pH 形式在 SDH(R55Q) 中占主导地位。SDH（R55Q）的EPR光谱的pH依赖性，其中带正电荷的精氨酸被中性亲水性谷氨酰胺取代，与SDH（WT）显着不同。对于 SDH(R55Q)，结合硫酸盐的封闭形式是在低 pH 值下生成的，正如在用 (33)S 标记的亚硫酸盐还原时观察到的 (33)S 偶联所证实的那样。对 SDH(R55Q) 结合硫酸盐的这一观察结果支持我们之前的假设，即亚硫酸盐氧化酶可以表现出多种电子转移和产物释放途径（Emesh 等，Biochemistry 48:2156-2163, 2009）。在 pH > 或 = 8 时，高 pH 形式在 SDH(R55Q) 中占主导地位。SDH（R55Q）的EPR光谱的pH依赖性，其中带正电荷的精氨酸被中性亲水性谷氨酰胺取代，与SDH（WT）显着不同。对于 SDH(R55Q)，结合硫酸盐的封闭形式是在低 pH 值下生成的，正如在用 (33)S 标记的亚硫酸盐还原时观察到的 (33)S 偶联所证实的那样。对 SDH(R55Q) 结合硫酸盐的这一观察结果支持我们之前的假设，即亚硫酸盐氧化酶可以表现出多种电子转移和产物释放途径（Emesh 等，Biochemistry 48:2156-2163, 2009）。在 pH > 或 = 8 时，高 pH 形式在 SDH(R55Q) 中占主导地位。对于 SDH(R55Q)，结合硫酸盐的封闭形式是在低 pH 值下生成的，正如在用 (33)S 标记的亚硫酸盐还原时观察到的 (33)S 偶联所证实的那样。SDH(R55Q) 结合硫酸盐的这一观察结果支持我们之前的假设，即亚硫酸盐氧化酶可以表现出多种电子转移和产物释放途径（Emesh 等人在 Biochemistry 48:2156-2163, 2009 中）。在 pH > 或 = 8 时，高 pH 形式在 SDH(R55Q) 中占主导地位。对于 SDH(R55Q)，结合硫酸盐的封闭形式是在低 pH 值下生成的，正如在用 (33)S 标记的亚硫酸盐还原时观察到的 (33)S 偶联所证实的那样。对 SDH(R55Q) 结合硫酸盐的这一观察结果支持我们之前的假设，即亚硫酸盐氧化酶可以表现出多种电子转移和产物释放途径（Emesh 等，Biochemistry 48:2156-2163, 2009）。在 pH > 或 = 8 时，高 pH 形式在 SDH(R55Q) 中占主导地位。