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Reversed Phase-Liquid Chromatography for Recombinant AAV Genome Integrity Assessment
Analytical Chemistry ( IF 6.7 ) Pub Date : 2023-05-23 , DOI: 10.1021/acs.analchem.3c00222 Christoph Gstöttner 1 , Andrei Hutanu 2 , Sacha Boon 1 , Aurelia Raducanu 3 , Klaus Richter 4 , Markus Haindl 3 , Raphael Ruppert 3 , Elena Domínguez-Vega 1
Analytical Chemistry ( IF 6.7 ) Pub Date : 2023-05-23 , DOI: 10.1021/acs.analchem.3c00222 Christoph Gstöttner 1 , Andrei Hutanu 2 , Sacha Boon 1 , Aurelia Raducanu 3 , Klaus Richter 4 , Markus Haindl 3 , Raphael Ruppert 3 , Elena Domínguez-Vega 1
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After decades of research, gene therapy products have reached market maturity in recent years. Recombinant adeno-associated viruses (rAAVs) are one of the most promising gene delivery vehicles and are currently under intense scientific investigation. These next-generation medicines remain very challenging when it comes to designing appropriate analytical techniques for quality control. One critical quality attribute is the integrity of ssDNA incorporated in these vectors. The genome is the active compound driving rAAV therapy and therefore requires proper assessment and quality control. Current techniques for rAAV genome characterization include next-generation sequencing, quantitative polymerase chain reaction, analytical ultracentrifugation (AUC), and capillary gel electrophoresis (CGE), yet each of them presents their limitations or lack of user-friendliness. In this work, we demonstrate for the first time the potential of ion pairing-reverse phase-liquid chromatography (IP-RP-LC) to characterize the integrity of rAAV genomes. The obtained results were supported by two orthogonal techniques, AUC and CGE. IP-RP-LC can be performed above DNA melting temperatures, avoiding the detection of secondary DNA isoforms, and does not require the use of dyes due to UV detection. We demonstrate that this technique is suitable for batch comparability, different rAAV serotypes (AAV2 and AAV8), internal vs external (inside vs outside the capsid) DNA analysis, and contaminated samples. Overall, it is exceptionally user-friendly, needs limited sample preparation, has high reproducibility, and permits fractionation for further peak characterization. All of these factors add significant value of IP-RP-LC to the analytical toolbox of rAAV genome assessment.
中文翻译：
用于重组 AAV 基因组完整性评估的反相液相色谱
经过数十年的研究，基因治疗产品在最近几年已达到市场成熟度。重组腺相关病毒 (rAAV) 是最有前途的基因传递载体之一，目前正在进行深入的科学研究。在设计用于质量控制的适当分析技术时，这些下一代药物仍然非常具有挑战性。一个关键的质量属性是这些载体中掺入的 ssDNA 的完整性。基因组是驱动 rAAV 治疗的活性化合物，因此需要适当的评估和质量控制。目前用于 rAAV 基因组表征的技术包括下一代测序、定量聚合酶链反应、分析超速离心 (AUC) 和毛细管凝胶电泳 (CGE)，然而，它们中的每一个都存在局限性或缺乏用户友好性。在这项工作中，我们首次展示了离子对-反相-液相色谱 (IP-RP-LC) 表征 rAAV 基因组完整性的潜力。获得的结果得到两种正交技术 AUC 和 CGE 的支持。IP-RP-LC 可以在 DNA 熔解温度以上进行，避免检测二级 DNA 异构体，并且由于 UV 检测不需要使用染料。我们证明该技术适用于批次可比性、不同 rAAV 血清型（AAV2 和 AAV8）、内部与外部（衣壳内部与外部）DNA 分析以及受污染的样本。总的来说，它非常用户友好，需要有限的样品制备，具有高重现性，并允许分馏以进一步表征峰。所有这些因素都为 rAAV 基因组评估的分析工具箱增加了 IP-RP-LC 的重要价值。
更新日期：2023-05-23
中文翻译：
用于重组 AAV 基因组完整性评估的反相液相色谱
经过数十年的研究，基因治疗产品在最近几年已达到市场成熟度。重组腺相关病毒 (rAAV) 是最有前途的基因传递载体之一，目前正在进行深入的科学研究。在设计用于质量控制的适当分析技术时，这些下一代药物仍然非常具有挑战性。一个关键的质量属性是这些载体中掺入的 ssDNA 的完整性。基因组是驱动 rAAV 治疗的活性化合物，因此需要适当的评估和质量控制。目前用于 rAAV 基因组表征的技术包括下一代测序、定量聚合酶链反应、分析超速离心 (AUC) 和毛细管凝胶电泳 (CGE)，然而，它们中的每一个都存在局限性或缺乏用户友好性。在这项工作中，我们首次展示了离子对-反相-液相色谱 (IP-RP-LC) 表征 rAAV 基因组完整性的潜力。获得的结果得到两种正交技术 AUC 和 CGE 的支持。IP-RP-LC 可以在 DNA 熔解温度以上进行，避免检测二级 DNA 异构体，并且由于 UV 检测不需要使用染料。我们证明该技术适用于批次可比性、不同 rAAV 血清型（AAV2 和 AAV8）、内部与外部（衣壳内部与外部）DNA 分析以及受污染的样本。总的来说，它非常用户友好，需要有限的样品制备，具有高重现性，并允许分馏以进一步表征峰。所有这些因素都为 rAAV 基因组评估的分析工具箱增加了 IP-RP-LC 的重要价值。
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