Despite advances in bacterial genome engineering, delivery of large synthetic constructs remains challenging in practice. In this study, we propose a straightforward and robust approach for the markerless integration of DNA fragments encoding whole metabolic pathways into the genome. This approach relies on the replacement of a counterselection marker with cargo DNA cassettes via λRed recombineering. We employed a counterselection strategy involving a genetic circuit based on the CI repressor of λ phage. Our design ensures elimination of most spontaneous mutants, and thus provides a counterselection stringency close to the maximum possible. We improved the efficiency of integrating long PCR-generated cassettes by exploiting the Ocr antirestriction function of T7 phage, which completely prevents degradation of unmethylated DNA by restriction endonucleases in wild-type bacteria. The employment of highly restrictive counterselection and ocr-assisted λRed recombineering allowed markerless integration of operon-sized cassettes into arbitrary genomic loci of four enterobacterial species with an efficiency of 50–100%. In the case of Escherichia coli, our strategy ensures simple combination of markerless mutations in a single strain via P1 transduction. Overall, the proposed approach can serve as a general tool for synthetic biology and metabolic engineering in a range of bacterial hosts.

中文翻译：

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强大的反选择和先进的 λRed 重组技术可实现大型异源构建体的无标记染色体整合

尽管细菌基因组工程取得了进展，但大型合成构建体的交付在实践中仍然具有挑战性。在这项研究中，我们提出了一种直接且稳健的方法，用于将编码整个代谢途径的 DNA 片段无标记整合到基因组中。这种方法依赖于通过 λRed 重组工程用货物 DNA 盒替换反选择标记。我们采用了一种反选择策略，涉及基于 λ 噬菌体的 CI 阻遏物的遗传回路。我们的设计确保消除大多数自发突变体，从而提供接近最大可能的反选择严格性。我们通过利用 T7 噬菌体的 Ocr 抗限制功能提高了整合长 PCR 生成的盒的效率，这完全防止了野生型细菌中限制性核酸内切酶对未甲基化 DNA 的降解。使用高度限制性的反选择和 ocr 辅助的 λRed 重组工程允许将操纵子大小的盒无标记地整合到四种肠细菌物种的任意基因组基因座中，效率为 50-100%。在大肠杆菌的情况下，我们的策略确保通过 P1 转导在单个菌株中简单组合无标记突变。总体而言，所提出的方法可以作为合成生物学和代谢工程在一系列细菌宿主中的通用工具。使用高度限制性的反选择和 ocr 辅助的 λRed 重组工程允许将操纵子大小的盒无标记地整合到四种肠细菌物种的任意基因组基因座中，效率为 50-100%。在大肠杆菌的情况下，我们的策略确保通过 P1 转导在单个菌株中简单组合无标记突变。总体而言，所提出的方法可以作为合成生物学和代谢工程在一系列细菌宿主中的通用工具。使用高度限制性的反选择和 ocr 辅助的 λRed 重组工程允许将操纵子大小的盒无标记地整合到四种肠细菌物种的任意基因组基因座中，效率为 50-100%。在大肠杆菌的情况下，我们的策略确保通过 P1 转导在单个菌株中简单组合无标记突变。总体而言，所提出的方法可以作为合成生物学和代谢工程在一系列细菌宿主中的通用工具。