BACKGROUND Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is an autosomal recessive disorder that has been included in newborn screening programs. Current approaches to gene testing for CAH are facing challenges because of the complexity of the CYP21A2 locus and genetic heterogeneity of the disease. METHODS A comprehensive analysis of CAH (CACAH) combining long-range locus-specific PCR and long-read sequencing (LRS) was developed to perform full sequence analysis of 5 common CAH candidate genes, including CYP21A2, CYP11B1, CYP17A1, HSD3B2, and StAR. In a blind retrospective study, the clinical utility of CACAH was evaluated in 37 samples by comparing to standard CAH testing using multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) plus Sanger sequencing. RESULTS Of the 37 clinical samples, a total of 69 pathogenic variants were identified, comprising 65 CYP21A2 variants, 2 HSD3B2 variants, and 2 CYP17A1 variants. For CYP21A2, the most frequent variant was c.518T > A (29.2%), followed by c.293-13C/A > G (21.5%). Compared with the current CAH testing using MLPA plus Sanger sequencing, the CACAH assay showed 100% specificity and 100% sensitivity, and precisely determined the junction sites of deletions/insertions and cis-trans configuration of multiple variants without analyzing family samples. Moreover, CACAH identified a case carrying 2 copies of CYP21A1 with the c.1451_1452delinsC variant on the same chromosome, which was not confirmed by MLPA plus Sanger sequencing. CONCLUSION LRS-based CACAH can determine all genotypes of CAH accurately and reliably in one assay, presenting a comprehensive approach for CAH genetic diagnosis and carrier screening.

中文翻译：

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使用长读长测序综合分析先天性肾上腺增生。

背景技术先天性肾上腺增生（CAH）是一种常染色体隐性遗传疾病，已被纳入新生儿筛查项目。由于 CYP21A2 基因座的复杂性和疾病的遗传异质性，目前 CAH 基因检测方法面临挑战。方法 结合长距离位点特异性PCR和长读长测序（LRS）对CAH（CACAH）进行综合分析，对CYP21A2、CYP11B1、CYP17A1、HSD3B2和StAR等5个常见CAH候选基因进行全序列分析。 . 在一项盲回顾性研究中，通过与使用多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 加 Sanger 测序的标准 CAH 测试进行比较，在 37 个样本中评估了 CACAH 的临床效用。结果 37份临床样本中，共鉴定出69种致病变异，包括 65 个 CYP21A2 变体、2 个 HSD3B2 变体和 2 个 CYP17A1 变体。对于 CYP21A2，最常见的变异是 c.518T > A (29.2%)，其次是 c.293-13C/A > G (21.5%)。与目前使用 MLPA 加 Sanger 测序的 CAH 检测相比，CACAH 检测显示出 100% 的特异性和 100% 的灵敏度，并且无需分析家族样本即可精确确定多个变异的缺失/插入和顺反构型的连接位点。此外，CACAH 发现一例携带 2 个 CYP21A1 拷贝的病例，其同一染色体上带有 c.1451_1452delinsC 变体，MLPA 加 Sanger 测序未证实这一点。结论基于LRS的CACAH可以在一次检测中准确可靠地确定CAH的所有基因型，为CAH基因诊断和携带者筛查提供了一种综合方法。2 个 HSD3B2 变体和 2 个 CYP17A1 变体。对于 CYP21A2，最常见的变异是 c.518T > A (29.2%)，其次是 c.293-13C/A > G (21.5%)。与目前使用 MLPA 加 Sanger 测序的 CAH 检测相比，CACAH 检测显示出 100% 的特异性和 100% 的灵敏度，并且无需分析家族样本即可精确确定多个变异的缺失/插入和顺反构型的连接位点。此外，CACAH 发现一例携带 2 个 CYP21A1 拷贝的病例，其同一染色体上带有 c.1451_1452delinsC 变体，MLPA 加 Sanger 测序未证实这一点。结论基于LRS的CACAH可以在一次检测中准确可靠地确定CAH的所有基因型，为CAH基因诊断和携带者筛查提供了一种综合方法。2 个 HSD3B2 变体和 2 个 CYP17A1 变体。对于 CYP21A2，最常见的变异是 c.518T > A (29.2%)，其次是 c.293-13C/A > G (21.5%)。与目前使用 MLPA 加 Sanger 测序的 CAH 检测相比，CACAH 检测显示出 100% 的特异性和 100% 的灵敏度，并且无需分析家族样本即可精确确定多个变异的缺失/插入和顺反构型的连接位点。此外，CACAH 发现一例携带 2 个 CYP21A1 拷贝的病例，其同一染色体上带有 c.1451_1452delinsC 变体，MLPA 加 Sanger 测序未证实这一点。结论基于LRS的CACAH可以在一次检测中准确可靠地确定CAH的所有基因型，为CAH基因诊断和携带者筛查提供了一种综合方法。最常见的变异是 c.518T > A (29.2%)，其次是 c.293-13C/A > G (21.5%)。与目前使用 MLPA 加 Sanger 测序的 CAH 检测相比，CACAH 检测显示出 100% 的特异性和 100% 的灵敏度，并且无需分析家族样本即可精确确定多个变异的缺失/插入和顺反构型的连接位点。此外，CACAH 发现一例携带 2 个 CYP21A1 拷贝的病例，其同一染色体上带有 c.1451_1452delinsC 变体，MLPA 加 Sanger 测序未证实这一点。结论基于LRS的CACAH可以在一次检测中准确可靠地确定CAH的所有基因型，为CAH基因诊断和携带者筛查提供了一种综合方法。最常见的变异是 c.518T > A (29.2%)，其次是 c.293-13C/A > G (21.5%)。与目前使用 MLPA 加 Sanger 测序的 CAH 检测相比，CACAH 检测显示出 100% 的特异性和 100% 的灵敏度，并且无需分析家族样本即可精确确定多个变异的缺失/插入和顺反构型的连接位点。此外，CACAH 发现一例携带 2 个 CYP21A1 拷贝的病例，其同一染色体上带有 c.1451_1452delinsC 变体，MLPA 加 Sanger 测序未证实这一点。结论基于LRS的CACAH可以在一次检测中准确可靠地确定CAH的所有基因型，为CAH基因诊断和携带者筛查提供了一种综合方法。与目前使用 MLPA 加 Sanger 测序的 CAH 检测相比，CACAH 检测显示出 100% 的特异性和 100% 的灵敏度，并且无需分析家族样本即可精确确定多个变异的缺失/插入和顺反构型的连接位点。此外，CACAH 发现一例携带 2 个 CYP21A1 拷贝的病例，其同一染色体上带有 c.1451_1452delinsC 变体，MLPA 加 Sanger 测序未证实这一点。结论基于LRS的CACAH可以在一次检测中准确可靠地确定CAH的所有基因型，为CAH基因诊断和携带者筛查提供了一种综合方法。与目前使用 MLPA 加 Sanger 测序的 CAH 检测相比，CACAH 检测显示出 100% 的特异性和 100% 的灵敏度，并且无需分析家族样本即可精确确定多个变异的缺失/插入和顺反构型的连接位点。此外，CACAH 发现一例携带 2 个 CYP21A1 拷贝的病例，其同一染色体上带有 c.1451_1452delinsC 变体，MLPA 加 Sanger 测序未证实这一点。结论基于LRS的CACAH可以在一次检测中准确可靠地确定CAH的所有基因型，为CAH基因诊断和携带者筛查提供了一种综合方法。无需分析家族样本，即可精确确定多个变体的缺失/插入和顺反构型的连接位点。此外，CACAH 发现一例携带 2 个 CYP21A1 拷贝的病例，其同一染色体上带有 c.1451_1452delinsC 变体，MLPA 加 Sanger 测序未证实这一点。结论基于LRS的CACAH可以在一次检测中准确可靠地确定CAH的所有基因型，为CAH基因诊断和携带者筛查提供了一种综合方法。无需分析家族样本，即可精确确定多个变体的缺失/插入和顺反构型的连接位点。此外，CACAH 发现一例携带 2 个 CYP21A1 拷贝的病例，其同一染色体上带有 c.1451_1452delinsC 变体，MLPA 加 Sanger 测序未证实这一点。结论基于LRS的CACAH可以在一次检测中准确可靠地确定CAH的所有基因型，为CAH基因诊断和携带者筛查提供了一种综合方法。