Isatis indigotica accumulates several active substances, including C-glycosylflavonoids, which have important pharmacological activities and health benefits. However, enzymes catalyzing the methylation step of C-glycosylflavonoids in I. indigotica remain unknown. In this study, three OMTs were identified from I. indigotica that have the capacity for the O-methylation of the C-glycosylflavonoid, isoorientin. The Type II OMTs, IiOMT1 and IiOMT2, efficiently catalyze isoorientin to form isoscoparin, and decorate one of the aromatic vicinal hydroxyl groups on flavones and methylate the C6, C8, and 3'-hydroxyl positions to form oroxylin A, wogonin, and chrysoeriol, respectively. However, the Type I OMT, IiOMT3, exhibited broader substrate promiscuity and methylated the C7 and 3'-hydroxyl positions of flavonoids. Further site-directed mutagenesis studies demonstrated that five amino acids of IiOMT1/IiOMT2 (D121/D100, D173/D149, A174/A150R, N200/N176, and D248/D233) were critical residues for their catalytic activity. Additionally, only transient overexpression of Type II OMTs, IiOMT1 and IiOMT2, in Nicotiana benthamiana significantly increased isoscoparin accumulation, indicating that Type II OMTs, IiOMT1 and IiOMT2, could catalyze the methylation step of C-glycosylflavonoid, isoorientin at the 3'-hydroxyl position. This study provides insights into methylated C-glycosylflavonoids biosynthesis, which could be promising catalysts to synthesize bioactive compounds.

中文翻译：

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两种板蓝根 O-甲基转移酶甲基化 C-糖基类黄酮的鉴定和表征

Isatis indigotica 积累了几种活性物质，包括 C-糖基类黄酮，它们具有重要的药理活性和健康益处。然而，在靛蓝中催化 C-糖基类黄酮甲基化步骤的酶仍然未知。在这项研究中，从靛蓝中鉴定出三种 OMT，它们具有 C-糖基类黄酮异荭草素的 O-甲基化能力。II 型 OMT，即 IiOMT1 和 IiOMT2，可有效催化异荭草素形成异芫荽素，并修饰黄酮上的一个芳族连位羟基并将 C6、C8 和 3'-羟基位置甲基化以形成 oroxylin A、汉黄芩素和金黄素，分别。然而，I 型 OMT，IiOMT3，表现出更广泛的底物混杂性和甲基化黄酮类化合物的 C7 和 3'-羟基位置。进一步的定点诱变研究表明，IiOMT1/IiOMT2 的五个氨基酸（D121/D100、D173/D149、A174/A150R、N200/N176 和 D248/D233）是其催化活性的关键残基。此外，仅在本氏烟草中，II 型 OMT、IiOMT1 和 IiOMT2 的瞬时过表达显着增加了异芫荽素的积累，表明 II 型 OMT、IiOMT1 和 IiOMT2 可以催化 C-糖基类黄酮、异荭草素在 3'-羟基位置的甲基化步骤. 这项研究提供了对甲基化 C-糖基类黄酮生物合成的见解，这可能是合成生物活性化合物的有希望的催化剂。仅在本氏烟草中，II 型 OMT、IiOMT1 和 IiOMT2 的瞬时过表达显着增加了异芫荽素的积累，表明 II 型 OMT、IiOMT1 和 IiOMT2 可以催化 C-糖基类黄酮、异荭草素在 3'-羟基位置的甲基化步骤。这项研究提供了对甲基化 C-糖基类黄酮生物合成的见解，这可能是合成生物活性化合物的有希望的催化剂。仅在本氏烟草中，II 型 OMT、IiOMT1 和 IiOMT2 的瞬时过表达显着增加了异芫荽素的积累，表明 II 型 OMT、IiOMT1 和 IiOMT2 可以催化 C-糖基类黄酮、异荭草素在 3'-羟基位置的甲基化步骤。这项研究提供了对甲基化 C-糖基类黄酮生物合成的见解，这可能是合成生物活性化合物的有希望的催化剂。