Hazardous small molecules in food and environment seriously threatens human health, which requires sensitive and rapid tools for monitoring. Using a previously identified nanobody against ochratoxin A (OTA), we herein proposed a homogeneous sensing platform “nanobody/NanoLuc Binary Technology (NanoBiT) system” and developed a nanobody/NanoBiT system-mediated bioluminescence immunosensor (NBL-Immunosens) for OTA using LgBiT (Lg) and SmBiT (Sm), two subunits of the split nanoluciferase (NanoLuc). The core elements of NBL-Immunosens include Lg-nanobody fusion (NLg) and Sm-labeled OTA-bovine serum albumin conjugate (OSm). The antigen-antibody interaction between NLg and OSm triggers the reconstitution of NanoLuc for generating luminescence signals. Moreover, free OTA can compete with OSm for binding to NLg, resulting the decrease of dose-dependent signals. NBL-Immunosens can detect OTA in a one-step assay of 5 min without washing and exhibit a limit of detection of 0.01 ng/mL with a linear range of 0.04–2.23 ng/mL. It shows high selectivity for OTA and has good accuracy and precision in the spiking-and-recovery experiments. Furthermore, its effectiveness was evaluated with real cereal samples and confirmed by liquid chromatography tandem mass spectrometry and commercial ELISA kits. Hence, the NBL-Immunosens is a very promising tool for rapid, accurate, and selective detection of trace OTA in food.

食品和环境中的有害小分子严重威胁人类健康，需要灵敏、快速的监测工具。使用先前确定的抗赭曲霉毒素 A (OTA) 的纳米体，我们在此提出了一个均质传感平台“纳米体/NanoLuc 二元技术 (NanoBiT) 系统”，并开发了一种使用 LgBiT 的纳米体/NanoBiT 系统介导的生物发光免疫传感器 (NBL-Immunosens) (Lg) 和 SmBiT (Sm)，分裂纳米荧光素酶 (NanoLuc) 的两个亚基。NBL-Immunosens 的核心元素包括 Lg-纳米抗体融合 (NLg) 和 Sm 标记的 OTA-牛血清白蛋白偶联物 (OSm)。NLg 和 OSm 之间的抗原-抗体相互作用触发 NanoLuc 的重构以产生发光信号。此外，免费 OTA 可以与 OSm 竞争与 NLg 的绑定，导致剂量依赖性信号的减少。NBL-Immunosens 可以在 5 分钟的一步测定中检测 OTA，无需洗涤，检测限为 0.01 ng/mL，线性范围为 0.04–2.23 ng/mL。它对OTA显示出高选择性，在加标和恢复实验中具有良好的准确度和精密度。此外，其有效性通过实际谷物样品进行评估，并通过液相色谱串联质谱和商业 ELISA 试剂盒进行确认。因此，NBL-Immunosens 是一种非常有前途的工具，可用于快速、准确和选择性地检测食品中的痕量 OTA。它对OTA显示出高选择性，在加标和恢复实验中具有良好的准确度和精密度。此外，其有效性通过实际谷物样品进行评估，并通过液相色谱串联质谱和商业 ELISA 试剂盒进行确认。因此，NBL-Immunosens 是一种非常有前途的工具，可用于快速、准确和选择性地检测食品中的痕量 OTA。它对OTA显示出高选择性，在加标和恢复实验中具有良好的准确度和精密度。此外，其有效性通过实际谷物样品进行评估，并通过液相色谱串联质谱和商业 ELISA 试剂盒进行确认。因此，NBL-Immunosens 是一种非常有前途的工具，可用于快速、准确和选择性地检测食品中的痕量 OTA。