Abstract

Development of lab-on-a-chip (LOC) system based on integration of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) and microfluidic technology is expected to speed up SARS-CoV-2 diagnostics allowing early intervention. In the current work, reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) and RT-LAMP assays were performed on extracted RNA of seven wastewater samples from COVID-19 hotspots. RT‑LAMP assay was also performed on wastewater samples without RNA extraction. Current detection of SARS-CoV-2 is mainly by RT-qPCR of ORF (ORF1ab) and N genes so we targeted both to find the best target gene for SARS-CoV-2 detection. We also performed RT-LAMP with/without RNA extraction inside microfluidic device to target both genes. Positivity rates of RT-qPCR and RT-LAMP performed on extracted RNA were 100.0% (7/7) and 85.7% (6/7), respectively. RT-qPCR results revealed that all 7 wastewater samples were positive for N gene (Ct range 37–39), and negative for ORF1ab, suggesting that N gene could be the best target gene for SARS-CoV-2 detection. RT-LAMP of N and ORF (ORF1a) genes performed on wastewater samples without RNA extraction indicated that all 7 samples remains pink (negative). The color remains pink in all microchannels except microchannels which subjected to RT-LAMP for targeting N region after RNA extraction (yellow color) in 6 out of 7 samples. This study shows that SARS-CoV-2 was successfully detected from wastewater samples using RT-LAMP in microfluidic chips. This study brings the novelty involving the use of wastewater samples for detection of SARS-CoV-2 without previous virus concentration and with/without RNA extraction.

Graphical abstract

中文翻译：

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集成 RT-LAMP 和微流控技术检测废水中的 SARS-CoV-2 作为先进的护理点平台

摘要

基于逆转录环介导等温扩增 (RT-LAMP) 和微流体技术集成的芯片实验室 ​​(LOC) 系统的开发有望加速 SARS-CoV-2 诊断，从而实现早期干预。在目前的工作中，对从 COVID-19 热点的七个废水样本中提取的 RNA 进行了逆转录酶定量聚合酶链反应 (RT-qPCR) 和 RT-LAMP 测定。还对未经 RNA 提取的废水样品进行了 RT‑LAMP 测定。目前对 SARS-CoV-2 的检测主要通过 ORF (ORF1ab) 和 N 基因的 RT-qPCR 进行，因此我们针对这两者寻找 SARS-CoV-2 检测的最佳靶基因。我们还在微流体装置内进行了有/无 RNA 提取的 RT-LAMP 以靶向这两个基因。对提取的 RNA 进行的 RT-qPCR 和 RT-LAMP 的阳性率为 100。分别为 0% (7/7) 和 85.7% (6/7)。RT-qPCR 结果显示，所有 7 个废水样本均为 N 基因阳性（Ct 范围 37-39），而 ORF1ab 阴性，表明 N 基因可能是 SARS-CoV-2 检测的最佳靶基因。对未经 RNA 提取的废水样品进行的 N 和 ORF (ORF1a) 基因的 RT-LAMP 表明所有 7 个样品都保持粉红色（阴性）。颜色在所有微通道中保持粉红色，除了在 7 个样品中的 6 个样品中进行 RT-LAMP 以靶向 N 区域后的 RNA 提取（黄色）。这项研究表明，使用微流控芯片中的 RT-LAMP 成功地从废水样品中检测到了 SARS-CoV-2。这项研究带来了新颖性，涉及使用废水样本检测 SARS-CoV-2，而无需事先进行病毒浓缩和提取/不提取 RNA。分别为 7% (6/7)。RT-qPCR 结果显示，所有 7 个废水样本均为 N 基因阳性（Ct 范围 37-39），而 ORF1ab 阴性，表明 N 基因可能是 SARS-CoV-2 检测的最佳靶基因。对未经 RNA 提取的废水样品进行的 N 和 ORF (ORF1a) 基因的 RT-LAMP 表明所有 7 个样品都保持粉红色（阴性）。颜色在所有微通道中保持粉红色，除了在 7 个样品中的 6 个样品中进行 RT-LAMP 以靶向 N 区域后的 RNA 提取（黄色）。这项研究表明，使用微流控芯片中的 RT-LAMP 成功地从废水样品中检测到了 SARS-CoV-2。这项研究带来了新颖性，涉及使用废水样本检测 SARS-CoV-2，而无需事先进行病毒浓缩和提取/不提取 RNA。分别为 7% (6/7)。RT-qPCR 结果显示，所有 7 个废水样本均为 N 基因阳性（Ct 范围 37-39），而 ORF1ab 阴性，表明 N 基因可能是 SARS-CoV-2 检测的最佳靶基因。对未经 RNA 提取的废水样品进行的 N 和 ORF (ORF1a) 基因的 RT-LAMP 表明所有 7 个样品都保持粉红色（阴性）。颜色在所有微通道中保持粉红色，除了在 7 个样品中的 6 个样品中进行 RT-LAMP 以靶向 N 区域后的 RNA 提取（黄色）。这项研究表明，使用微流控芯片中的 RT-LAMP 成功地从废水样品中检测到了 SARS-CoV-2。这项研究带来了新颖性，涉及使用废水样本检测 SARS-CoV-2，而无需事先进行病毒浓缩和提取/不提取 RNA。RT-qPCR 结果显示，所有 7 个废水样本均为 N 基因阳性（Ct 范围 37-39），而 ORF1ab 阴性，表明 N 基因可能是 SARS-CoV-2 检测的最佳靶基因。对未经 RNA 提取的废水样品进行的 N 和 ORF (ORF1a) 基因的 RT-LAMP 表明所有 7 个样品都保持粉红色（阴性）。颜色在所有微通道中保持粉红色，除了在 7 个样品中的 6 个样品中进行 RT-LAMP 以靶向 N 区域后的 RNA 提取（黄色）。这项研究表明，使用微流控芯片中的 RT-LAMP 成功地从废水样品中检测到了 SARS-CoV-2。这项研究带来了新颖性，涉及使用废水样本检测 SARS-CoV-2，而无需事先进行病毒浓缩和提取/不提取 RNA。RT-qPCR 结果显示，所有 7 个废水样本均为 N 基因阳性（Ct 范围 37-39），而 ORF1ab 阴性，表明 N 基因可能是 SARS-CoV-2 检测的最佳靶基因。对未经 RNA 提取的废水样品进行的 N 和 ORF (ORF1a) 基因的 RT-LAMP 表明所有 7 个样品都保持粉红色（阴性）。颜色在所有微通道中保持粉红色，除了在 7 个样品中的 6 个样品中进行 RT-LAMP 以靶向 N 区域后的 RNA 提取（黄色）。这项研究表明，使用微流控芯片中的 RT-LAMP 成功地从废水样品中检测到了 SARS-CoV-2。这项研究带来了新颖性，涉及使用废水样本检测 SARS-CoV-2，而无需事先进行病毒浓缩和提取/不提取 RNA。

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