Ceramide is a lipid molecule that regulates diverse physiological and pathological reactions in part through inverting the topology of certain transmembrane proteins. This topological inversion is achieved through regulated alternative translocation (RAT), which reverses the direction by which membrane proteins are translocated across the endoplasmic reticulum during translation. However, owing to technical challenges in studying protein-ceramide interaction, it remains unclear how ceramide levels are sensed in cells to trigger RAT. Here, we report the synthesis of pac-C7-Cer, a photoactivatable and clickable short-chain ceramide analog that can be used as a probe to study protein-ceramide interactions. We demonstrate that translocating chain-associated membrane protein 2 (TRAM2), a protein known to control RAT of transmembrane 4 L6 subfamily member 20, and TRAM1, a homolog of TRAM2, interacted with molecules derived from pac-C7-Cer. This interaction was competed by naturally existing long-chain ceramide molecules. We showed that binding of ceramide and its analogs to TRAM2 correlated with their ability to induce RAT of transmembrane 4 L6 subfamily member 20. In addition to probing ceramide-TRAM interactions, we provide evidence that pac-C7-cer could be used for proteome-wide identification of ceramide-binding proteins. Our study provides mechanistic insights into RAT by identifying TRAMs as potential ceramide-binding proteins and establishes pac-C7-Cer as a valuable tool for future study of ceramide-protein interactions.

中文翻译：

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使用可光激活和可点击的短链神经酰胺类似物将 TRAM 鉴定为鞘脂结合蛋白。

神经酰胺是一种脂质分子，部分通过反转某些跨膜蛋白的拓扑结构来调节多种生理和病理反应。这种拓扑反转是通过调节替代易位 (RAT) 实现的，它反转了膜蛋白在翻译过程中跨内质网易位的方向。然而，由于研究蛋白质-神经酰胺相互作用的技术挑战，目前尚不清楚细胞中如何感知神经酰胺水平以触发 RAT。在这里，我们报告了 pac-C7-Cer 的合成，这是一种可光激活和可点击的短链神经酰胺类似物，可用作研究蛋白质-神经酰胺相互作用的探针。我们证明易位链相关膜蛋白 2 (TRAM2)，已知控制跨膜 4 L6 亚家族成员 20 的 RAT 的蛋白质和 TRAM2 的同源物 TRAM1 与衍生自 pac-C7-Cer 的分子相互作用。这种相互作用由天然存在的长链神经酰胺分子竞争。我们发现神经酰胺及其类似物与 TRAM2 的结合与它们诱导跨膜 4 L6 亚家族成员 20 的 RAT 的能力相关。除了探测神经酰胺-TRAM 相互作用外，我们还提供了 pac-C7-cer 可用于蛋白质组的证据。广泛鉴定神经酰胺结合蛋白。我们的研究通过将 TRAM 鉴定为潜在的神经酰胺结合蛋白提供了对 RAT 的机制见解，并将 pac-C7-Cer 确立为未来研究神经酰胺-蛋白质相互作用的有价值的工具。这种相互作用由天然存在的长链神经酰胺分子竞争。我们发现神经酰胺及其类似物与 TRAM2 的结合与它们诱导跨膜 4 L6 亚家族成员 20 的 RAT 的能力相关。除了探测神经酰胺-TRAM 相互作用外，我们还提供了 pac-C7-cer 可用于蛋白质组的证据。广泛鉴定神经酰胺结合蛋白。我们的研究通过将 TRAM 鉴定为潜在的神经酰胺结合蛋白，提供了对 RAT 的机制见解，并将 pac-C7-Cer 确立为未来研究神经酰胺-蛋白质相互作用的有价值的工具。这种相互作用由天然存在的长链神经酰胺分子竞争。我们发现神经酰胺及其类似物与 TRAM2 的结合与它们诱导跨膜 4 L6 亚家族成员 20 的 RAT 的能力相关。除了探测神经酰胺-TRAM 相互作用外，我们还提供了 pac-C7-cer 可用于蛋白质组的证据。广泛鉴定神经酰胺结合蛋白。我们的研究通过将 TRAM 鉴定为潜在的神经酰胺结合蛋白，提供了对 RAT 的机制见解，并将 pac-C7-Cer 确立为未来研究神经酰胺-蛋白质相互作用的有价值的工具。除了探测神经酰胺-TRAM 相互作用外，我们还提供了 pac-C7-cer 可用于全蛋白质组鉴定神经酰胺结合蛋白的证据。我们的研究通过将 TRAM 鉴定为潜在的神经酰胺结合蛋白，提供了对 RAT 的机制见解，并将 pac-C7-Cer 确立为未来研究神经酰胺-蛋白质相互作用的有价值的工具。除了探测神经酰胺-TRAM 相互作用外，我们还提供了 pac-C7-cer 可用于全蛋白质组鉴定神经酰胺结合蛋白的证据。我们的研究通过将 TRAM 鉴定为潜在的神经酰胺结合蛋白提供了对 RAT 的机制见解，并将 pac-C7-Cer 确立为未来研究神经酰胺-蛋白质相互作用的有价值的工具。