DJ-1 is known to play neuroprotective roles by eliminating reactive oxygen species (ROS) as an antioxidant protein. However, the molecular mechanism of DJ-1 function has not been well elucidated. This study explored the structural and functional changes of DJ-1 in response to oxidative stress. Human DJ-1 has three cysteine residues (Cys46, Cys53 and Cys106). We found that, in addition to Cys106, Cys46 is the most reactive cysteine residue in DJ-1, which was identified employing an NPSB-B chemical probe (Ctag) that selectively reacts with redox-sensitive cysteine sulfhydryl. Peroxidatic Cys46 readily formed an intra-disulfide bond with adjacent resolving Cys53, which was identified with nanoUPLC-ESI-q-TOF tandem mass spectrometry (MS/MS) employing DBond algorithm under the non-reducing condition. Mutants (C46A and C53A), not forming Cys46–Cys53 disulfide cross-linking, increased oxidation of Cys106 to sulfinic and sulfonic acids. Furthermore, we found that DJ-1 C46A mutant has distorted unstable structure identified by biochemical assay and employing hydrogen/deuterium exchange-mass spectrometry (HDX-MS) analysis. All three Cys mutants lost antioxidant activities in SN4741 cell, a dopaminergic neuronal cell, unlike WT DJ-1. These findings suggest that all three Cys residues including Cys46–Cys53 disulfide cross-linking are required for maintaining the structural integrity, the regulation process and cellular function as an antioxidant protein. These studies broaden the understanding of regulatory mechanisms of DJ-1 that operate under oxidative conditions.

中文翻译：

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逐步氧化在 DJ-1 的结构和功能调节中起关键作用

众所周知，DJ-1 通过消除作为抗氧化蛋白的活性氧 (ROS) 发挥神经保护作用。然而，DJ-1功能的分子机制尚未得到很好的阐明。本研究探讨了 DJ-1 响应氧化应激的结构和功能变化。人 DJ-1 具有三个半胱氨酸残基（Cys46、Cys53 和 Cys106）。我们发现，除了 Cys106 之外，Cys46 是 DJ-1 中反应性最强的半胱氨酸残基，它是使用 NPSB-B 化学探针 (Ctag) 鉴定的，该探针选择性地与氧化还原敏感的半胱氨酸巯基反应。过氧化物 Cys46 很容易与相邻的解析 Cys53 形成内二硫键，在非还原条件下使用 DBond 算法使用 nanoUPLC-ESI-q-TOF 串联质谱 (MS/MS) 对其进行鉴定。突变体（C46A 和 C53A），不形成 Cys46-Cys53 二硫化物交联，增加 Cys106 氧化为亚磺酸和磺酸。此外，我们发现 DJ-1 C46A 突变体扭曲了通过生化测定和氢/氘交换质谱 (HDX-MS) 分析鉴定的不稳定结构。与 WT DJ-1 不同，所有三种 Cys 突变体在多巴胺能神经元细胞 SN4741 细胞中都失去了抗氧化活性。这些发现表明，包括 Cys46-Cys53 二硫键交联在内的所有三个 Cys 残基都是维持结构完整性、调节过程和作为抗氧化蛋白的细胞功能所必需的。这些研究拓宽了对氧化条件下 DJ-1 调节机制的理解。我们发现 DJ-1 C46A 突变体扭曲了通过生化测定和氢/氘交换质谱 (HDX-MS) 分析鉴定的不稳定结构。与 WT DJ-1 不同，所有三种 Cys 突变体在多巴胺能神经元细胞 SN4741 细胞中都失去了抗氧化活性。这些发现表明，包括 Cys46-Cys53 二硫键交联在内的所有三个 Cys 残基都是维持结构完整性、调节过程和作为抗氧化蛋白的细胞功能所必需的。这些研究拓宽了对氧化条件下 DJ-1 调节机制的理解。我们发现 DJ-1 C46A 突变体扭曲了通过生化测定和氢/氘交换质谱 (HDX-MS) 分析鉴定的不稳定结构。与 WT DJ-1 不同，所有三种 Cys 突变体在多巴胺能神经元细胞 SN4741 细胞中都失去了抗氧化活性。这些发现表明，包括 Cys46-Cys53 二硫键交联在内的所有三个 Cys 残基都是维持结构完整性、调节过程和作为抗氧化蛋白的细胞功能所必需的。这些研究拓宽了对氧化条件下 DJ-1 调节机制的理解。一种多巴胺能神经元细胞，与 WT DJ-1 不同。这些发现表明，包括 Cys46-Cys53 二硫键交联在内的所有三个 Cys 残基都是维持结构完整性、调节过程和作为抗氧化蛋白的细胞功能所必需的。这些研究拓宽了对氧化条件下 DJ-1 调节机制的理解。一种多巴胺能神经元细胞，与 WT DJ-1 不同。这些发现表明，包括 Cys46-Cys53 二硫键交联在内的所有三个 Cys 残基都是维持结构完整性、调节过程和作为抗氧化蛋白的细胞功能所必需的。这些研究拓宽了对氧化条件下 DJ-1 调节机制的理解。