The purification of low-abundance protein complexes and detection of in vivo protein–protein interactions in complex biological samples remains a challenging task. Here, we devised crosslinking and tandem affinity purification coupled to mass spectrometry (XL–TAP–MS), a quantitative proteomics approach for analyzing tandem affinity-purified, crosslinked protein complexes from plant tissues. We exemplarily applied XL–TAP–MS to study the MKK2–Mitogen-activated protein kinase (MPK4) signaling module in Arabidopsis thaliana. A tandem affinity tag consisting of an in vivo-biotinylated protein domain flanked by two hexahistidine sequences was adopted to allow for the affinity-based isolation of formaldehyde–crosslinked protein complexes under fully denaturing conditions. Combined with 15N stable isotopic labeling and tandem MS we captured and identified a total of 107 MKK2–MPK4 module-interacting proteins. Consistent with the role of the MPK signaling module in plant immunity, many of the module-interacting proteins are involved in the biotic and abiotic stress response of Arabidopsis. Validation of binary protein–protein interactions by in planta split-luciferase assays and in vitro kinase assays disclosed several direct phosphorylation targets of MPK4. Together, the XL–TAP–MS approach purifies low abundance protein complexes from biological samples and discovers previously unknown protein–protein interactions.

中文翻译：

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通过 XL-TAP-MS 纯化 MAP-激酶蛋白复合物和鉴定候选成分

低丰度蛋白质复合物的纯化和复杂生物样品中蛋白质-蛋白质相互作用的检测仍然是一项具有挑战性的任务。在这里，我们设计了与质谱 (XL-TAP-MS) 耦合的交联和串联亲和纯化，这是一种定量蛋白质组学方法，用于分析来自植物组织的串联亲和纯化的交联蛋白复合物。我们示例性地应用 XL-TAP-MS 来研究拟南芥中的 MKK2-丝裂原活化蛋白激酶 (MPK4) 信号模块。采用由两个六组氨酸序列两侧的体内生物素化蛋白质结构域组成的串联亲和标签，以允许在完全变性条件下基于亲和分离甲醛交联的蛋白质复合物。结合 15N 稳定同位素标记和串联 MS，我们捕获并鉴定了总共 107 个 MKK2-MPK4 模块相互作用蛋白。与 MPK 信号模块在植物免疫中的作用一致，许多模块相互作用蛋白参与了拟南芥的生物和非生物胁迫反应。通过植物内分裂荧光素酶测定和体外激酶测定验证二元蛋白质-蛋白质相互作用揭示了 MPK4 的几个直接磷酸化靶标。总之，XL-TAP-MS 方法从生物样品中纯化低丰度蛋白质复合物，并发现以前未知的蛋白质-蛋白质相互作用。许多模块相互作用蛋白参与拟南芥的生物和非生物胁迫反应。通过植物内分裂荧光素酶测定和体外激酶测定验证二元蛋白质-蛋白质相互作用揭示了 MPK4 的几个直接磷酸化靶标。总之，XL-TAP-MS 方法从生物样品中纯化低丰度蛋白质复合物，并发现以前未知的蛋白质-蛋白质相互作用。许多模块相互作用蛋白参与拟南芥的生物和非生物胁迫反应。通过植物内分裂荧光素酶测定和体外激酶测定验证二元蛋白质-蛋白质相互作用揭示了 MPK4 的几个直接磷酸化靶标。总之，XL-TAP-MS 方法从生物样品中纯化低丰度蛋白质复合物，并发现以前未知的蛋白质-蛋白质相互作用。