Charcot-Marie-Tooth (CMT) disease is one of the most common genetically inherited neurological disorders and CMT type 2A (CMT 2A) is caused by dominant mutations in the mitofusin-2 (MFN2) gene. MFN2 is located in the outer mitochondrial membrane and is a mediator of mitochondrial fusion, with an essential role in maintaining normal neuronal functions. Although loss of MFN2 induces axonal neuropathy, the detailed mechanism by which MFN2 deficiency results in axonal degeneration of human spinal motor neurons remains largely unknown. In this study, we generated MFN2-knockdown human embryonic stem cell (hESC) lines using lentivirus expressing MFN2 short hairpin RNA (shRNA). Using these hESC lines, we found that MFN2 loss did not affect spinal motor neuron differentiation from hESCs but resulted in mitochondrial fragmentation and dysfunction as determined by live-cell imaging. Notably, MFN2-knockodwn spinal motor neurons exhibited CMT2A disease-related phenotypes, including extensive perikaryal inclusions of phosphorylated neurofilament heavy chain (pNfH), frequent axonal swellings, and increased pNfH levels in long-term cultures. Importantly, MFN2 deficit impaired anterograde and retrograde mitochondrial transport within axons, and reduced the mRNA and protein levels of kinesin and dynein, indicating the interfered motor protein expression induced by MFN2 deficiency. Our results reveal that MFN2 knockdown induced axonal degeneration of spinal motor neurons and defects in mitochondrial morphology and function. The impaired mitochondrial transport in MFN2-knockdown spinal motor neurons is mediated, at least partially, by the altered motor proteins, providing potential therapeutic targets for rescuing axonal degeneration of spinal motor neurons in CMT2A disease.

Charcot-Marie-Tooth (CMT) 病是最常见的遗传性神经系统疾病之一，CMT 2A 型 (CMT 2A) 是由 mitofusin-2 的显性突变引起的。MFN2) 基因。MFN2位于线粒体外膜，是线粒体融合的介质，在维持正常神经元功能方面具有重要作用。尽管 MFN2 的缺失会诱发轴突神经病变，但 MFN2 缺乏导致人类脊髓运动神经元轴突变性的详细机制仍然未知。在这项研究中，我们使用表达 MFN2 短发夹 RNA (shRNA) 的慢病毒生成了 MFN2 敲低的人类胚胎干细胞 (hESC) 系。使用这些 hESC 系，我们发现 MFN2 缺失不影响脊髓运动神经元与 hESC 的分化，但会导致活细胞成像确定的线粒体断裂和功能障碍。值得注意的是，MFN2-knockodwn 脊髓运动神经元表现出 CMT2A 疾病相关表型，包括磷酸化神经丝重链 (pNfH) 的广泛核周包涵体、频繁的轴突肿胀和长期培养中 pNfH 水平增加。重要的是，MFN2 缺陷会损害轴突内的顺行和逆行线粒体转运，并降低驱动蛋白和动力蛋白的 mRNA 和蛋白质水平，表明 MFN2 缺陷诱导的运动蛋白表达受到干扰。我们的结果表明 MFN2 敲低诱导脊髓运动神经元的轴突变性和线粒体形态和功能的缺陷。MFN2 敲低脊髓运动神经元中受损的线粒体转运至少部分是由改变的运动蛋白介导的，这为挽救 CMT2A 疾病中脊髓运动神经元的轴突变性提供了潜在的治疗靶点。并在长期培养中增加 pNfH 水平。重要的是，MFN2 缺陷会损害轴突内的顺行和逆行线粒体转运，并降低驱动蛋白和动力蛋白的 mRNA 和蛋白质水平，表明 MFN2 缺陷诱导的运动蛋白表达受到干扰。我们的结果表明 MFN2 敲低诱导脊髓运动神经元的轴突变性和线粒体形态和功能的缺陷。MFN2 敲低脊髓运动神经元中受损的线粒体转运至少部分是由改变的运动蛋白介导的，这为挽救 CMT2A 疾病中脊髓运动神经元的轴突变性提供了潜在的治疗靶点。并在长期培养中增加 pNfH 水平。重要的是，MFN2 缺陷会损害轴突内的顺行和逆行线粒体转运，并降低驱动蛋白和动力蛋白的 mRNA 和蛋白质水平，表明 MFN2 缺陷诱导的运动蛋白表达受到干扰。我们的结果表明 MFN2 敲低诱导脊髓运动神经元的轴突变性和线粒体形态和功能的缺陷。MFN2 敲低脊髓运动神经元中受损的线粒体转运至少部分是由改变的运动蛋白介导的，这为挽救 CMT2A 疾病中脊髓运动神经元的轴突变性提供了潜在的治疗靶点。并降低驱动蛋白和动力蛋白的 mRNA 和蛋白质水平，表明 MFN2 缺陷诱导的运动蛋白表达受到干扰。我们的结果表明 MFN2 敲低诱导脊髓运动神经元的轴突变性和线粒体形态和功能的缺陷。MFN2 敲低脊髓运动神经元中受损的线粒体转运至少部分是由改变的运动蛋白介导的，这为挽救 CMT2A 疾病中脊髓运动神经元的轴突变性提供了潜在的治疗靶点。并降低驱动蛋白和动力蛋白的 mRNA 和蛋白质水平，表明 MFN2 缺陷诱导的运动蛋白表达受到干扰。我们的结果表明 MFN2 敲低诱导脊髓运动神经元的轴突变性和线粒体形态和功能的缺陷。MFN2 敲低脊髓运动神经元中受损的线粒体转运至少部分是由改变的运动蛋白介导的，这为挽救 CMT2A 疾病中脊髓运动神经元的轴突变性提供了潜在的治疗靶点。