The widespread use of CRISPR/Cas9 as a programmable genome editing tool has been hindered by off-target DNA cleavage (Cong et al., 2013; Doudna, 2020; Fu et al., 2013; Jinek et al., 2013). While analysis of such off-target editing events have enabled the development of Cas9 variants with greater discrimination against mismatches (Chen et al., 2017; Kleinstiver et al., 2016; Slaymaker et al., 2016), the underlying molecular mechanisms by which Cas9 rejects or accepts mismatches are poorly understood (Kim et al., 2019; Liu et al., 2020; Slaymaker and Gaudelli, 2021). Here, we used kinetic analysis to guide cryo-EM structure determination of Cas9 at different stages of mismatch surveillance. We observe a distinct, previously undescribed linear conformation of the duplex formed between the guide RNA (gRNA) and DNA target strand (TS), that occurs in the presence of PAM-distal mismatches, preventing Cas9 activation. The canonical kinked gRNA:TS duplex is a prerequisite for Cas9 activation, acting as a structural scaffold to facilitate Cas9 conformational rearrangements necessary for DNA cleavage. We observe that highly tolerated PAM-distal mismatches achieve this kinked conformation through stabilization of a distorted duplex conformation via a flexible loop in the RuvC domain. Our results provide molecular insights into the underlying structural mechanisms that may facilitate off-target cleavage by Cas9 and provides a molecular blueprint for the design of next-generation high fidelity Cas9 variants that selectively reduce off-target DNA cleavage while retaining efficient cleavage of on-target DNA.

中文翻译：

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CRISPR/Cas9错配监测的结构基础

脱靶 DNA 切割阻碍了 CRISPR/Cas9 作为可编程基因组编辑工具的广泛使用（Cong 等，2013；Doudna，2020；Fu 等，2013；Jinek 等，2013）。虽然对此类脱靶编辑事件的分析使得 Cas9 变体的开发能够更好地识别错配（Chen 等人，2017 年；Kleinstiver 等人，2016 年；Slaymaker 等人，2016 年），但其潜在的分子机制是人们对 Cas9 拒绝或接受错配知之甚少（Kim 等人，2019 年；Liu 等人，2020 年；Slaymaker 和 Gaudelli，2021 年）。在这里，我们使用动力学分析来指导在错配监测的不同阶段确定 Cas9 的冷冻电镜结构。我们观察到在引导 RNA (gRNA) 和 DNA 靶链 (TS) 之间形成的双链体的独特的、以前未描述的线性构象，在存在 PAM 远端错配的情况下发生，阻止 Cas9 激活。典型的扭结 gRNA:TS 双链体是 Cas9 激活的先决条件，作为结构支架促进 DNA 切割所需的 Cas9 构象重排。我们观察到高度耐受的 PAM 远端错配通过 RuvC 域中的灵活环稳定扭曲的双链构象来实现这种扭曲的构象。我们的结果提供了对可能促进 Cas9 脱靶切割的潜在结构机制的分子见解，并为下一代高保真 Cas9 变体的设计提供了分子蓝图，这些变体选择性地减少脱靶 DNA 切割，同时保持有效切割。目标 DNA。典型的扭结 gRNA:TS 双链体是 Cas9 激活的先决条件，作为结构支架促进 DNA 切割所需的 Cas9 构象重排。我们观察到高度耐受的 PAM 远端错配通过 RuvC 域中的灵活环稳定扭曲的双链构象来实现这种扭曲的构象。我们的结果提供了对可能促进 Cas9 脱靶切割的潜在结构机制的分子见解，并为下一代高保真 Cas9 变体的设计提供了分子蓝图，这些变体选择性地减少脱靶 DNA 切割，同时保持有效切割。目标 DNA。典型的扭结 gRNA:TS 双链体是 Cas9 激活的先决条件，作为结构支架促进 DNA 切割所需的 Cas9 构象重排。我们观察到高度耐受的 PAM 远端错配通过 RuvC 域中的灵活环稳定扭曲的双链构象来实现这种扭曲的构象。我们的结果提供了对可能促进 Cas9 脱靶切割的潜在结构机制的分子见解，并为下一代高保真 Cas9 变体的设计提供了分子蓝图，这些变体选择性地减少脱靶 DNA 切割，同时保持有效切割。目标 DNA。作为结构支架，促进 DNA 切割所需的 Cas9 构象重排。我们观察到高度耐受的 PAM 远端错配通过 RuvC 域中的灵活环稳定扭曲的双链构象来实现这种扭曲的构象。我们的结果提供了对可能促进 Cas9 脱靶切割的潜在结构机制的分子见解，并为下一代高保真 Cas9 变体的设计提供了分子蓝图，这些变体选择性地减少脱靶 DNA 切割，同时保持有效切割。目标 DNA。作为结构支架，促进 DNA 切割所需的 Cas9 构象重排。我们观察到高度耐受的 PAM 远端错配通过 RuvC 域中的灵活环稳定扭曲的双链构象来实现这种扭曲的构象。我们的结果提供了对可能促进 Cas9 脱靶切割的潜在结构机制的分子见解，并为下一代高保真 Cas9 变体的设计提供了分子蓝图，这些变体选择性地减少脱靶 DNA 切割，同时保持有效切割。目标 DNA。