N⁶-methyladenosine (m6A) is the most abundant post-transcriptional modification in RNA and has important implications in physiological processes and tumor development. However, sensitive and specific quantification of locus-specific m6A modification levels remains a challenging task. In the present work, a novel m6A-sensitive DNAzyme was utilized to directly detect m6A by coupling with a three-way junction-mediated isothermal exponential CRISPR amplification reaction for the first time. This method was built on the fact that the binding arm of the DNAzyme bound to the specific site and its core structure catalyzed the selective cleavage of unmodified adenine instead of methylated adenines. Subsequently, the intact RNA was identified by the proximity effect of the three-way junction. Enormous amounts of single-stranded DNA products were generated through a combination of SDA and EXPAR for signal amplification. The specific real-time curve of products was recorded through detecting the fluorescence intensity triggered by CRISPR Cas12a. As a result, methylation target of abundance down to 1% was successfully identified. In addition, this strategy could be used for the analysis of cell RNA extracts. Combined with an electrochemical sensor for quantitative detection of RNA methylation, we demonstrated the generality of as-proposed strategy. We envision the present method would provide a new platform for the analysis of m6A in RNA and promote its application in clinical diseases.

N ⁶-甲基腺苷 (m6A) 是 RNA 中最丰富的转录后修饰，在生理过程和肿瘤发展中具有重要意义。然而，位点特异性 m6A 修饰水平的敏感和特异性量化仍然是一项具有挑战性的任务。在目前的工作中，首次利用新型 m6A 敏感 DNAzyme 通过与三路连接介导的等温指数 CRISPR 扩增反应偶联直接检测 m6A。该方法建立在以下事实之上：DNAzyme 的结合臂与特定位点结合，其核心结构催化选择性切割未修饰的腺嘌呤而不是甲基化的腺嘌呤。随后，通过三路连接的邻近效应鉴定了完整的 RNA。通过 SDA 和 EXPAR 的组合用于信号放大，产生了大量的单链 DNA 产物。通过检测CRISPR Cas12a触发的荧光强度，记录产品的特定实时曲线。结果，成功确定了丰度低至 1% 的甲基化目标。此外，该策略可用于分析细胞 RNA 提取物。结合用于定量检测 RNA 甲基化的电化学传感器，我们证明了所提出策略的通用性。我们设想本方法将为分析 RNA 中的 m6A 提供一个新平台，并促进其在临床疾病中的应用。通过检测CRISPR Cas12a触发的荧光强度，记录产品的特定实时曲线。结果，成功确定了丰度低至 1% 的甲基化目标。此外，该策略可用于分析细胞 RNA 提取物。结合用于定量检测 RNA 甲基化的电化学传感器，我们证明了所提出策略的通用性。我们设想本方法将为分析 RNA 中的 m6A 提供一个新平台，并促进其在临床疾病中的应用。通过检测CRISPR Cas12a触发的荧光强度，记录产品的特定实时曲线。结果，成功确定了丰度低至 1% 的甲基化目标。此外，该策略可用于分析细胞 RNA 提取物。结合用于定量检测 RNA 甲基化的电化学传感器，我们证明了所提出策略的通用性。我们设想本方法将为分析 RNA 中的 m6A 提供一个新平台，并促进其在临床疾病中的应用。我们展示了所提出策略的一般性。我们设想本方法将为分析 RNA 中的 m6A 提供一个新平台，并促进其在临床疾病中的应用。我们展示了所提出策略的一般性。我们设想本方法将为分析 RNA 中的 m6A 提供一个新平台，并促进其在临床疾病中的应用。