DevR/DosR response regulator is believed to participate in virulence, dormancy adaptation and antibiotic tolerance mechanisms of Mycobacterium tuberculosis by regulating the expression of the dormancy regulon. We have previously shown that the interaction of DevR with RNA polymerase is essential for the expression of DevR-regulated genes. Here, we developed a M. tuberculosis-specific in vivo transcription system to enrich our understanding of DevR–RNA polymerase interaction. This in vivo assay involves co-transforming E. coli with two plasmids that express α, β, β′ and σA subunits of M. tuberculosis RNA polymerase and a third plasmid that harbors a DevR expression cassette and a GFP reporter gene under the DevR-regulated fdxA promoter. We show that DevR-dependent transcription is sponsored exclusively by M. tuberculosis RNA polymerase and regulated by α and σA subunits of M. tuberculosis RNA polymerase. Using this E. coli triple plasmid system to express mutant variants of M. tuberculosis RNA polymerase, we identified E280 residue in C-terminal domain of α and K513 and R515 residues of σA to participate in DevR-dependent transcription. In silico modeling of a ternary complex of DevR, σA domain 4 and fdxA promoter suggest an interaction of Q505, R515 and K513 residues of σA with E178 and D172 residues of DevR and E471 of σA, respectively. These findings provide us with new insights into the interactions between DevR and RNA polymerase of M. tuberculosis which can be targeted for intercepting DevR function. Finally, we demonstrate the utility of this system for screening of anti-DevR compounds.

中文翻译：

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利用大肠杆菌对结核分枝杆菌 DevR 依赖性转录机制的功能洞察

DevR/DosR 反应调节器被认为通过调节休眠调节子的表达参与结核分枝杆菌的毒力、休眠适应和抗生素耐受机制。我们之前已经表明 DevR 与 RNA 聚合酶的相互作用对于 DevR 调节基因的表达是必不可少的。在这里，我们开发了一个结核分枝杆菌特异性的体内转录系统，以丰富我们对 DevR-RNA 聚合酶相互作用的理解。这种体内检测涉及用表达结核分枝杆菌 RNA 聚合酶的 α、β、β' 和 σA 亚基的两个质粒和第三个质粒共转化大肠杆菌，该质粒在 DevR-受调节的 fdxA 启动子。我们表明 DevR 依赖的转录完全由 M. 结核分枝杆菌 RNA 聚合酶，受结核分枝杆菌 RNA 聚合酶的 α 和 σA 亚基调节。使用这种大肠杆菌三重质粒系统来表达结核分枝杆菌 RNA 聚合酶的突变变体，我们在 α 和 K513 的 C 端结构域中鉴定了 E280 残基，以及 σA 的 R515 残基参与 DevR 依赖性转录。在 DevR、σA 结构域 4 和 fdxA 启动子的三元复合体的计算机模拟中，σA 的 Q505、R515 和 K513 残基分别与 DevR 的 E178 和 D172 残基以及σA 的 E471 残基相互作用。这些发现为我们提供了对 DevR 和结核分枝杆菌 RNA 聚合酶之间相互作用的新见解，可以靶向拦截 DevR 功能。最后，我们展示了该系统用于筛选抗 DevR 化合物的效用。使用这种大肠杆菌三重质粒系统来表达结核分枝杆菌 RNA 聚合酶的突变变体，我们在 α 和 K513 的 C 端结构域中鉴定了 E280 残基，以及 σA 的 R515 残基参与 DevR 依赖性转录。在 DevR、σA 结构域 4 和 fdxA 启动子的三元复合体的计算机模拟中，σA 的 Q505、R515 和 K513 残基分别与 DevR 的 E178 和 D172 残基以及σA 的 E471 残基相互作用。这些发现为我们提供了对 DevR 和结核分枝杆菌 RNA 聚合酶之间相互作用的新见解，可以靶向拦截 DevR 功能。最后，我们展示了该系统用于筛选抗 DevR 化合物的效用。使用这种大肠杆菌三重质粒系统来表达结核分枝杆菌 RNA 聚合酶的突变变体，我们在 α 和 K513 的 C 端结构域中鉴定了 E280 残基，以及 σA 的 R515 残基参与 DevR 依赖性转录。在 DevR、σA 结构域 4 和 fdxA 启动子的三元复合体的计算机模拟中，σA 的 Q505、R515 和 K513 残基分别与 DevR 的 E178 和 D172 残基以及σA 的 E471 残基相互作用。这些发现为我们提供了对 DevR 和结核分枝杆菌 RNA 聚合酶之间相互作用的新见解，可以靶向拦截 DevR 功能。最后，我们展示了该系统用于筛选抗 DevR 化合物的效用。我们在α的C端结构域和σA的K513和R515残基中鉴定出E280残基参与DevR依赖性转录。在 DevR、σA 结构域 4 和 fdxA 启动子的三元复合体的计算机模拟中，σA 的 Q505、R515 和 K513 残基分别与 DevR 的 E178 和 D172 残基以及σA 的 E471 残基相互作用。这些发现为我们提供了对 DevR 和结核分枝杆菌 RNA 聚合酶之间相互作用的新见解，可以靶向拦截 DevR 功能。最后，我们展示了该系统用于筛选抗 DevR 化合物的效用。我们在α的C端结构域和σA的K513和R515残基中鉴定出E280残基参与DevR依赖性转录。在 DevR、σA 结构域 4 和 fdxA 启动子的三元复合体的计算机模拟中，σA 的 Q505、R515 和 K513 残基分别与 DevR 的 E178 和 D172 残基以及σA 的 E471 残基相互作用。这些发现为我们提供了关于 DevR 和结核分枝杆菌 RNA 聚合酶之间相互作用的新见解，可以靶向拦截 DevR 功能。最后，我们展示了该系统用于筛选抗 DevR 化合物的效用。σA 的 R515 和 K513 残基与 DevR 的 E178 和 D172 残基以及σA 的 E471 残基。这些发现为我们提供了对 DevR 和结核分枝杆菌 RNA 聚合酶之间相互作用的新见解，可以靶向拦截 DevR 功能。最后，我们展示了该系统用于筛选抗 DevR 化合物的效用。σA 的 R515 和 K513 残基与 DevR 的 E178 和 D172 残基以及σA 的 E471 残基。这些发现为我们提供了对 DevR 和结核分枝杆菌 RNA 聚合酶之间相互作用的新见解，可以靶向拦截 DevR 功能。最后，我们展示了该系统用于筛选抗 DevR 化合物的效用。