Asthenozoospermia (ASZ) is a condition characterized by reduced forward motility of spermatozoa affecting approximately 19% of infertile men. A kinase anchor protein 4 (AKAP4) is an X-linked testis-specific gene and plays a major role in sperm motility and flagella formation. However, few studies have reported its association with ASZ. Here, we sequenced for exonic mutations of human AKAP4 gene by high-fidelity PCR/Sanger sequencing in peripheral blood samples from 150 ASZ patients and 150 fertile men. We reported the identification of three novel hemizygous mutations unique to four ASZ patients, including one patient carrying missense mutation c.454T>C (p.S152P), two patient carrying synonymous mutation c.1173T>C (p.H391H), and one patient carrying synonymous mutation c.2007 A>G (p.R669R). The p.S152P mutation was located in a precursor pro-polypeptide domain of AKAP4 protein, which was predicted to be damaging by SIFT and PolyPhen-2 and could cause the protein accumulation in the cytoplasm of COS-7 cells. The mature protein of AKAP4 was absent in spermatozoa of ASZ patient harboring AKAP4 p.S152P mutation. Further in vitro cellular assays showed that reactive oxygen species (ROS), malondialdehyde (MDA), myeloperoxidase (MPO) levels, and apoptotic cells were increased in GC2-spd cells by AKAP4 p.S152P mutant protein, whereas superoxide dismutase (SOD) level was decreased. AKAP4 p.H391H and p.R669R mutant proteins were coimmunoprecipitated with ribonuclease T2 (RNASET2) protein in GC2-spd cells, whereas no interaction between the AKAP4 p.S152P mutant protein and RNASET2 protein was observed. In addition, AKAP4 p.S152P mutant protein could decrease the activity of PKA/PI3K signaling. Overall, our study identifies a novel AKAP4 p.S152P mutation is associated with ASZ probably through affecting oxidative stress and cell apoptosis by regulating the interaction with RNASET2 and the activity of the PKA/PI3K signaling pathway.

中文翻译：

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AKAP4基因中一个新的半合子错义突变c.454T＞C（p.S152P）与弱精子症有关

弱精子症 (ASZ) 是一种以精子向前运动减少为特征的疾病，影响约 19% 的不育男性。激酶锚定蛋白 4 ( AKAP4 ) 是 X 连锁睾丸特异性基因，在精子活力和鞭毛形成中起主要作用。然而，很少有研究报告其与 ASZ 的关联。在这里，我们对人类AKAP4的外显子突变进行了测序通过高保真 PCR/Sanger 测序对来自 150 名 ASZ 患者和 150 名有生育能力的男性的外周血样本进行基因测序。我们报告了四名 ASZ 患者特有的三种新型半合子突变的鉴定，包括一名携带错义突变 c.454T>C (p.S152P) 的患者、两名携带同义突变 c.1173T>C (p.H391H) 的患者和一名携带同义突变 c.1173T>C (p.H391H) 的患者。携带同义突变 c.2007 A>G (p.R669R) 的患者。p.S152P突变位于AKAP4蛋白的前体多肽前体结构域，预计SIFT和PolyPhen-2会破坏该蛋白，并可能导致COS-7细胞细胞质中的蛋白质积累。AKAP4 的成熟蛋白在携带 AKAP4 p.S152P 突变的 ASZ 患者的精子中不存在。进一步的体外细胞试验表明，活性氧 (ROS)、丙二醛 (MDA)、AKAP4 p.S152P 突变蛋白增加了 GC2-spd 细胞中髓过氧化物酶 (MPO) 水平和凋亡细胞，而超氧化物歧化酶 (SOD) 水平降低。AKAP4 p.H391H 和 p.R669R 突变蛋白在 GC2-spd 细胞中与核糖核酸酶 T2 (RNASET2) 蛋白共免疫沉淀，而没有观察到 AKAP4 p.S152P 突变蛋白和 RNASET2 蛋白之间的相互作用。此外，AKAP4 p.S152P突变蛋白可以降低PKA/PI3K信号的活性。总体而言，我们的研究确定了一种新的 AKAP4 p.S152P 突变与 ASZ 相关，可能通过调节与 RNASET2 的相互作用和 PKA/PI3K 信号通路的活性来影响氧化应激和细胞凋亡。而超氧化物歧化酶（SOD）水平降低。AKAP4 p.H391H 和 p.R669R 突变蛋白在 GC2-spd 细胞中与核糖核酸酶 T2 (RNASET2) 蛋白共免疫沉淀，而没有观察到 AKAP4 p.S152P 突变蛋白和 RNASET2 蛋白之间的相互作用。此外，AKAP4 p.S152P突变蛋白可以降低PKA/PI3K信号的活性。总体而言，我们的研究确定了一种新的 AKAP4 p.S152P 突变与 ASZ 相关，可能通过调节与 RNASET2 的相互作用和 PKA/PI3K 信号通路的活性来影响氧化应激和细胞凋亡。而超氧化物歧化酶（SOD）水平降低。AKAP4 p.H391H 和 p.R669R 突变蛋白在 GC2-spd 细胞中与核糖核酸酶 T2 (RNASET2) 蛋白共免疫沉淀，而没有观察到 AKAP4 p.S152P 突变蛋白和 RNASET2 蛋白之间的相互作用。此外，AKAP4 p.S152P突变蛋白可以降低PKA/PI3K信号的活性。总体而言，我们的研究确定了一种新的 AKAP4 p.S152P 突变与 ASZ 相关，可能通过调节与 RNASET2 的相互作用和 PKA/PI3K 信号通路的活性来影响氧化应激和细胞凋亡。此外，AKAP4 p.S152P突变蛋白可以降低PKA/PI3K信号的活性。总体而言，我们的研究确定了一种新的 AKAP4 p.S152P 突变与 ASZ 相关，可能通过调节与 RNASET2 的相互作用和 PKA/PI3K 信号通路的活性来影响氧化应激和细胞凋亡。此外，AKAP4 p.S152P突变蛋白可以降低PKA/PI3K信号的活性。总体而言，我们的研究确定了一种新的 AKAP4 p.S152P 突变与 ASZ 相关，可能通过调节与 RNASET2 的相互作用和 PKA/PI3K 信号通路的活性来影响氧化应激和细胞凋亡。