Folates are indispensable for plant development, but their molecular mode of action remains elusive. We synthesized a probe, “5-F-THF-Dayne,” comprising 5-formyl-tetrahydrofolate (THF) coupled to a photoaffinity tag. Exploiting this probe in an affinity proteomics study in Arabidopsis thaliana, we retrieved 51 hits. Thirty interactions were independently validated with in vitro expressed proteins to bind 5-F-THF with high or low affinity. Interestingly, the interactors reveal associations beyond one-carbon metabolism, covering also connections to nitrogen (N) metabolism, carbohydrate metabolism/photosynthesis, and proteostasis. Two of the interactions, one with the folate biosynthetic enzyme DIHYDROFOLATE REDUCTASE-THYMIDYLATE SYNTHASE 1 (AtDHFR-TS1) and another with N metabolism-associated glutamine synthetase 1;4 (AtGLN1;4), were further characterized. In silico and experimental analyses revealed G35/K36 and E330 as key residues for the binding of 5-F-THF in AtDHFR-TS1 and AtGLN1;4, respectively. Site-directed mutagenesis of AtGLN1;4 E330, which co-localizes with the ATP-binding pocket, abolished 5-F-THF binding as well as AtGLN1;4 activity. Furthermore, 5-F-THF was noted to competitively inhibit the activities of AtDHFR-TS1 and AtGLN1;4. In summary, we demonstrated a regulatory role for 5-F-THF in N metabolism, revealed 5-F-THF-mediated feedback regulation of folate biosynthesis, and identified a total of 14 previously unknown high-affinity binding cellular targets of 5-F-THF. Together, this sets a landmark toward understanding the role of folates in plant development.

中文翻译：

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5-甲酰基-四氢叶酸蛋白质组将叶酸与 C/N 代谢联系起来，揭示叶酸生物合成的反馈调节

叶酸对于植物发育是必不可少的，但它们的分子作用方式仍然难以捉摸。我们合成了一种探针“5-F-THF-Dayne”，它包含与光亲和标签偶联的 5-甲酰基-四氢叶酸 (THF)。在拟南芥的亲和蛋白质组学研究中利用该探针，我们检索到 51 个命中。用体外表达的蛋白质独立验证了 30 种相互作用，以高或低亲和力结合 5-F-THF。有趣的是，相互作用因子揭示了单碳代谢之外的关联，还包括与氮 (N) 代谢、碳水化合物代谢/光合作用和蛋白质稳态的联系。其中两种相互作用，一种与叶酸生物合成酶二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶 1 (AtDHFR-TS1) 相互作用，另一种与 N 代谢相关的谷氨酰胺合成酶 1;4 (AtGLN1;4) 相互作用，进一步表征。计算机和实验分析显示 G35/K36 和 E330 分别是 AtDHFR-TS1 和 AtGLN1;4 中 5-F-THF 结合的关键残基。AtGLN1;4 E330 的定点诱变与 ATP 结合口袋共定位，消除了 5-F-THF 结合以及 AtGLN1;4 活性。此外，注意到 5-F-THF 竞争性抑制 AtDHFR-TS1 和 AtGLN1 的活性；4。总之，我们证明了 5-F-THF 在 N 代谢中的调节作用，揭示了 5-F-THF 介导的叶酸生物合成反馈调节，并确定了总共 14 个以前未知的 5-F 高亲和力结合细胞靶点-四氢呋喃。总之，这为了解叶酸在植物发育中的作用树立了里程碑。计算机和实验分析显示 G35/K36 和 E330 分别是 AtDHFR-TS1 和 AtGLN1;4 中 5-F-THF 结合的关键残基。AtGLN1;4 E330 的定点诱变与 ATP 结合口袋共定位，消除了 5-F-THF 结合以及 AtGLN1;4 活性。此外，注意到 5-F-THF 竞争性抑制 AtDHFR-TS1 和 AtGLN1 的活性；4。总之，我们证明了 5-F-THF 在 N 代谢中的调节作用，揭示了 5-F-THF 介导的叶酸生物合成反馈调节，并确定了总共 14 个以前未知的 5-F 高亲和力结合细胞靶点-四氢呋喃。总之，这为了解叶酸在植物发育中的作用树立了里程碑。计算机和实验分析显示 G35/K36 和 E330 分别是 AtDHFR-TS1 和 AtGLN1;4 中 5-F-THF 结合的关键残基。AtGLN1;4 E330 的定点诱变与 ATP 结合口袋共定位，消除了 5-F-THF 结合以及 AtGLN1;4 活性。此外，注意到 5-F-THF 竞争性抑制 AtDHFR-TS1 和 AtGLN1 的活性；4。总之，我们证明了 5-F-THF 在 N 代谢中的调节作用，揭示了 5-F-THF 介导的叶酸生物合成反馈调节，并确定了总共 14 个以前未知的 5-F 高亲和力结合细胞靶点-四氢呋喃。总之，这为了解叶酸在植物发育中的作用树立了里程碑。它与 ATP 结合口袋共定位，消除了 5-F-THF 结合以及 AtGLN1;4 活性。此外，注意到 5-F-THF 竞争性抑制 AtDHFR-TS1 和 AtGLN1 的活性；4。总之，我们证明了 5-F-THF 在 N 代谢中的调节作用，揭示了 5-F-THF 介导的叶酸生物合成反馈调节，并确定了总共 14 个以前未知的 5-F 高亲和力结合细胞靶点-四氢呋喃。总之，这为了解叶酸在植物发育中的作用树立了里程碑。它与 ATP 结合口袋共定位，消除了 5-F-THF 结合以及 AtGLN1;4 活性。此外，注意到 5-F-THF 竞争性抑制 AtDHFR-TS1 和 AtGLN1 的活性；4。总之，我们证明了 5-F-THF 在 N 代谢中的调节作用，揭示了 5-F-THF 介导的叶酸生物合成反馈调节，并确定了总共 14 个以前未知的 5-F 高亲和力结合细胞靶点-四氢呋喃。总之，这为了解叶酸在植物发育中的作用树立了里程碑。并确定了总共 14 个以前未知的 5-F-THF 高亲和力结合细胞靶标。总之，这为了解叶酸在植物发育中的作用树立了里程碑。并确定了总共 14 个以前未知的 5-F-THF 高亲和力结合细胞靶标。总之，这为了解叶酸在植物发育中的作用树立了里程碑。