Genetic code expansion is a powerful approach for advancing critical fields such as biological therapeutic discovery. However, the machinery for genetically encoding noncanonical amino acids (ncAAs) is only available in limited plasmid formats, constraining potential applications. In extreme cases, the introduction of two separate plasmids, one containing an orthogonal translation system (OTS) to facilitate ncAA incorporation and a second for expressing a ncAA-containing protein of interest, is not possible due to lack of convenient selection markers. One strategy to circumvent this challenge is to express the OTS and protein of interest from a single vector. For what we believe is the first time in yeast, we describe here several sets of single plasmid systems (SPSs) for performing genetic code manipulation and compare the ncAA incorporation capabilities of these plasmids against the capabilities of previously described dual plasmid systems (DPSs). For both dual fluorescent protein reporters and yeast display reporters tested with multiple OTSs and ncAAs, measured ncAA incorporation efficiencies with SPSs were determined to be equal to or improved relative to efficiencies determined with DPSs. Click chemistry on yeast cells displaying ncAA-containing proteins was also shown to be feasible in both formats, although differences in reactivity between formats suggest the need for caution when using such approaches. Additionally, we investigated whether these reporters would support separation of yeast strains known to exhibit distinct ncAA incorporation efficiencies. Model sorts conducted with mixtures of two strains transformed with the same SPS or DPS led to enrichment of a strain known to support higher efficiency ncAA incorporation, suggesting that these reporters will be suitable for conducting screens for strains exhibiting enhanced ncAA incorporation efficiencies. Overall, our results confirm that SPSs are well-behaved in yeast and provide a convenient alternative to DPSs. In particular, SPSs are expected to be invaluable for conducting high-throughput investigations of the effects of genetic or genomic changes on ncAA incorporation efficiency and, more fundamentally, the eukaryotic translation apparatus.

中文翻译：

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扩大用于定量评估酵母中非规范氨基酸掺入的工具包

遗传密码扩展是推进生物治疗发现等关键领域的有力方法。然而，遗传编码非规范氨基酸 (ncAAs) 的机制仅适用于有限的质粒格式，限制了潜在的应用。在极端情况下，由于缺乏方便的选择标记，不可能引入两个单独的质粒，一个包含正交翻译系统 (OTS) 以促进 ncAA 的合并，另一个用于表达含有 ncAA 的感兴趣蛋白质。规避这一挑战的一种策略是从单个载体表达 OTS 和感兴趣的蛋白质。因为我们相信这是第一次在酵母中，我们在这里描述了几套用于执行遗传密码操作的单质粒系统 (SPS)，并将这些质粒的 ncAA 掺入能力与先前描述的双质粒系统 (DPS) 的能力进行了比较。对于用多个 OTS 和 ncAA 测试的双荧光蛋白记者和酵母展示记者，测量的 ncAA 与 SPS 的合并效率被确定为等于或相对于 DPS 确定的效率有所提高。显示含有 ncAA 的蛋白质的酵母细胞上的点击化学也被证明在两种格式中都是可行的，尽管格式之间的反应性差异表明在使用此类方法时需要谨慎。此外，我们调查了这些记者是否支持分离已知表现出不同 ncAA 掺入效率的酵母菌株。使用相同 SPS 或 DPS 转化的两种菌株的混合物进行的模型分类导致已知支持更高效率 ncAA 掺入的菌株的富集，这表明这些记者将适合对表现出增强的 ncAA 掺入效率的菌株进行筛选。总体而言，我们的结果证实 SPS 在酵母中表现良好，并为 DPS 提供了方便的替代品。特别是，SPS 有望对遗传或基因组变化对 ncAA 掺入效率的影响进行高通量调查，更重要的是，对真核翻译装置的影响非常宝贵。使用相同 SPS 或 DPS 转化的两种菌株的混合物进行的模型分类导致已知支持更高效率 ncAA 掺入的菌株的富集，这表明这些记者将适合对表现出增强的 ncAA 掺入效率的菌株进行筛选。总体而言，我们的结果证实 SPS 在酵母中表现良好，并为 DPS 提供了方便的替代品。特别是，SPS 有望对遗传或基因组变化对 ncAA 掺入效率的影响进行高通量调查，更重要的是，对真核翻译装置的影响非常宝贵。使用相同 SPS 或 DPS 转化的两种菌株的混合物进行的模型分类导致已知支持更高效率 ncAA 掺入的菌株的富集，这表明这些记者将适合对表现出增强的 ncAA 掺入效率的菌株进行筛选。总体而言，我们的结果证实 SPS 在酵母中表现良好，并为 DPS 提供了方便的替代品。特别是，SPS 有望对遗传或基因组变化对 ncAA 掺入效率的影响进行高通量调查，更重要的是，对真核翻译装置的影响非常宝贵。表明这些记者将适合对表现出增强的 ncAA 掺入效率的菌株进行筛选。总体而言，我们的结果证实 SPS 在酵母中表现良好，并为 DPS 提供了方便的替代品。特别是，SPS 有望对遗传或基因组变化对 ncAA 掺入效率的影响进行高通量调查，更重要的是，对真核翻译装置的影响非常宝贵。表明这些记者将适合对表现出增强的 ncAA 掺入效率的菌株进行筛选。总体而言，我们的结果证实 SPS 在酵母中表现良好，并为 DPS 提供了方便的替代品。特别是，SPS 有望对遗传或基因组变化对 ncAA 掺入效率的影响进行高通量调查，更重要的是，对真核翻译装置的影响非常宝贵。