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Robustness of digital PCR and real-time PCR against inhibitors in transgene detection for gene doping control in equestrian sports
Drug Testing and Analysis ( IF 2.6 ) Pub Date : 2021-07-16 , DOI: 10.1002/dta.3131 Teruaki Tozaki 1 , Aoi Ohnuma 1 , Mio Kikuchi 1 , Taichiro Ishige 1 , Hironaga Kakoi 1 , Kei-Ichi Hirota 1 , Kanichi Kusano 2 , Shun-Ichi Nagata 1
Drug Testing and Analysis ( IF 2.6 ) Pub Date : 2021-07-16 , DOI: 10.1002/dta.3131 Teruaki Tozaki 1 , Aoi Ohnuma 1 , Mio Kikuchi 1 , Taichiro Ishige 1 , Hironaga Kakoi 1 , Kei-Ichi Hirota 1 , Kanichi Kusano 2 , Shun-Ichi Nagata 1
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Gene doping is a threat to fair competition in sports, both human and equestrian. One method of gene doping is to administer exogenous genetic materials, called transgenes, into the bodies of postnatal humans and horses. Polymerase chain reaction (PCR)-based transgene detection methods such as digital PCR and real-time PCR have been developed for gene doping testing in humans and horses. However, the significance of PCR inhibitors in gene doping testing has not been well evaluated. In this study, we evaluated the effects of PCR inhibitors on transgene detection using digital PCR and real-time PCR against gene doping. Digital PCR amplification was significantly inhibited by high concentrations of proteinase K (more than 0.1 μg/μl), ethylenediaminetetraacetic acid (more than 5 nmol/μl), and heparin (more than 0.05 unit/μl) but not by ethanol or genomic DNA. In addition, phenol affected droplet formation in the digital PCR amplification process. Real-time PCR amplification was inhibited by high concentrations of phenol (more than 1% v/v), proteinase K (more than 0.001 μg/μl), ethylenediaminetetraacetic acid (more than 1 nmol/μl), heparin (more than 0.005 unit/μl), and genomic DNA (more than 51.9 ng/μl) but not by ethanol. Although both PCR systems were inhibited by nearly the same substances, digital PCR was more robust than real-time PCR against the inhibitors. We believe that our findings are important for the development of better methods for transgene detection and prevention of false negative results in gene doping testing.
中文翻译：
数字 PCR 和实时 PCR 对马术运动中基因兴奋剂控制转基因检测中抑制剂的鲁棒性
基因兴奋剂对人类和马术运动的公平竞争构成威胁。基因掺杂的一种方法是将外源性遗传物质（称为转基因）注入出生后的人类和马的体内。已经开发了基于聚合酶链反应 (PCR) 的转基因检测方法，例如数字 PCR 和实时 PCR，用于人类和马的基因兴奋剂检测。然而，PCR 抑制剂在基因兴奋剂检测中的重要性尚未得到很好的评估。在这项研究中，我们评估了 PCR 抑制剂对使用数字 PCR 和实时 PCR 对基因掺杂进行转基因检测的影响。高浓度蛋白酶 K（大于 0.1 μg/μl）、乙二胺四乙酸（大于 5 nmol/μl）和肝素（大于 0. 05 单位/μl），但不是乙醇或基因组 DNA。此外，苯酚影响数字 PCR 扩增过程中的液滴形成。实时 PCR 扩增受到高浓度苯酚（大于 1% v/v）、蛋白酶 K（大于 0.001 μg/μl）、乙二胺四乙酸（大于 1 nmol/μl）、肝素（大于 0.005 单位）的抑制/μl）和基因组 DNA（超过 51.9 ng/μl），但不能通过乙醇。尽管两种 PCR 系统都受到几乎相同的物质的抑制，但数字 PCR 比实时 PCR 对抑制剂的抑制作用更强。我们相信我们的发现对于开发更好的转基因检测方法和防止基因兴奋剂检测中的假阴性结果非常重要。实时 PCR 扩增受到高浓度苯酚（大于 1% v/v）、蛋白酶 K（大于 0.001 μg/μl）、乙二胺四乙酸（大于 1 nmol/μl）、肝素（大于 0.005 单位）的抑制/μl）和基因组 DNA（超过 51.9 ng/μl），但不能通过乙醇。尽管两种 PCR 系统都受到几乎相同的物质的抑制，但数字 PCR 比实时 PCR 对抑制剂的抑制作用更强。我们相信我们的发现对于开发更好的转基因检测方法和防止基因兴奋剂检测中的假阴性结果非常重要。实时 PCR 扩增受到高浓度苯酚（大于 1% v/v）、蛋白酶 K（大于 0.001 μg/μl）、乙二胺四乙酸（大于 1 nmol/μl）、肝素（大于 0.005 单位）的抑制/μl）和基因组 DNA（超过 51.9 ng/μl），但不能通过乙醇。尽管两种 PCR 系统都受到几乎相同的物质的抑制，但数字 PCR 比实时 PCR 对抑制剂的抑制作用更强。我们相信我们的发现对于开发更好的转基因检测方法和防止基因兴奋剂检测中的假阴性结果非常重要。尽管两种 PCR 系统都受到几乎相同的物质的抑制，但数字 PCR 比实时 PCR 对抑制剂的抑制作用更强。我们相信我们的发现对于开发更好的转基因检测方法和防止基因兴奋剂检测中的假阴性结果非常重要。尽管两种 PCR 系统都受到几乎相同的物质的抑制，但数字 PCR 比实时 PCR 对抑制剂的抑制作用更强。我们相信我们的发现对于开发更好的转基因检测方法和防止基因兴奋剂检测中的假阴性结果非常重要。
更新日期：2021-07-16
中文翻译：
数字 PCR 和实时 PCR 对马术运动中基因兴奋剂控制转基因检测中抑制剂的鲁棒性
基因兴奋剂对人类和马术运动的公平竞争构成威胁。基因掺杂的一种方法是将外源性遗传物质（称为转基因）注入出生后的人类和马的体内。已经开发了基于聚合酶链反应 (PCR) 的转基因检测方法，例如数字 PCR 和实时 PCR，用于人类和马的基因兴奋剂检测。然而，PCR 抑制剂在基因兴奋剂检测中的重要性尚未得到很好的评估。在这项研究中，我们评估了 PCR 抑制剂对使用数字 PCR 和实时 PCR 对基因掺杂进行转基因检测的影响。高浓度蛋白酶 K（大于 0.1 μg/μl）、乙二胺四乙酸（大于 5 nmol/μl）和肝素（大于 0. 05 单位/μl），但不是乙醇或基因组 DNA。此外，苯酚影响数字 PCR 扩增过程中的液滴形成。实时 PCR 扩增受到高浓度苯酚（大于 1% v/v）、蛋白酶 K（大于 0.001 μg/μl）、乙二胺四乙酸（大于 1 nmol/μl）、肝素（大于 0.005 单位）的抑制/μl）和基因组 DNA（超过 51.9 ng/μl），但不能通过乙醇。尽管两种 PCR 系统都受到几乎相同的物质的抑制，但数字 PCR 比实时 PCR 对抑制剂的抑制作用更强。我们相信我们的发现对于开发更好的转基因检测方法和防止基因兴奋剂检测中的假阴性结果非常重要。实时 PCR 扩增受到高浓度苯酚（大于 1% v/v）、蛋白酶 K（大于 0.001 μg/μl）、乙二胺四乙酸（大于 1 nmol/μl）、肝素（大于 0.005 单位）的抑制/μl）和基因组 DNA（超过 51.9 ng/μl），但不能通过乙醇。尽管两种 PCR 系统都受到几乎相同的物质的抑制，但数字 PCR 比实时 PCR 对抑制剂的抑制作用更强。我们相信我们的发现对于开发更好的转基因检测方法和防止基因兴奋剂检测中的假阴性结果非常重要。实时 PCR 扩增受到高浓度苯酚（大于 1% v/v）、蛋白酶 K（大于 0.001 μg/μl）、乙二胺四乙酸（大于 1 nmol/μl）、肝素（大于 0.005 单位）的抑制/μl）和基因组 DNA（超过 51.9 ng/μl），但不能通过乙醇。尽管两种 PCR 系统都受到几乎相同的物质的抑制，但数字 PCR 比实时 PCR 对抑制剂的抑制作用更强。我们相信我们的发现对于开发更好的转基因检测方法和防止基因兴奋剂检测中的假阴性结果非常重要。尽管两种 PCR 系统都受到几乎相同的物质的抑制，但数字 PCR 比实时 PCR 对抑制剂的抑制作用更强。我们相信我们的发现对于开发更好的转基因检测方法和防止基因兴奋剂检测中的假阴性结果非常重要。尽管两种 PCR 系统都受到几乎相同的物质的抑制，但数字 PCR 比实时 PCR 对抑制剂的抑制作用更强。我们相信我们的发现对于开发更好的转基因检测方法和防止基因兴奋剂检测中的假阴性结果非常重要。
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